說到標準品,我們先說說絕對定量:絕對定量是指在實時熒光定量PCR實驗中,對已知量的樣本進行連續(xù)稀釋后擴增,生成標準曲線。然后通過與此曲線比較,定量未知樣本,絕對定量可測定靶點的實際拷貝數(shù)。包括以下三個步驟:
(1)將標準品稀釋成不同濃度,作為模板進行擴增;
(2)以標準品拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標,以測得的Ct值為縱坐標繪制標準曲線;
(3)根據(jù)未知樣品的Ct值,即可在標準曲線中獲得樣品的拷貝數(shù)。
以上可以看出標準品之于絕對定量是非常非常重要的,那么標準品該怎樣選擇?
在GB/T22554-2010《基于標準樣品的線性校準》中注明標準樣品的組分需要與被測樣品組分一致。
標準品 既可以是含有目的基因的線性化質(zhì)粒DNA,也可以是比目的基因擴增片段長的純化后的PCR產(chǎn)物,或者基因組DNA和cDNA,但是需要作為標準品的核酸必須保證穩(wěn)定并且需要精準定量。并且由于核酸提取、逆轉(zhuǎn)錄等實驗過程可能會影響反應(yīng)結(jié)果,所以需要注意標準品的實驗步驟應(yīng)與實驗樣品盡可能相同。常用標準品包括:
DNA標準品
純化的PCR擴增片段或含有目的基因的克隆質(zhì)粒。
優(yōu)點:易制備,儲存穩(wěn)定;
缺點:缺少逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)過程。
RNA標準品
目的基因的體外轉(zhuǎn)錄RNA。
優(yōu)點:結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)過程;
缺點:制備時間長,不穩(wěn)定。
標準品的制備流程
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