細胞和基因療法（Cell and Gene Therapy, CGT）是通過改變細胞原有基因的表達以達到治療疾病的方法，也即通過對人體細胞和基因進行修復(fù)、替換和改造，直接從患者的疾病根源進行治療，臨床應(yīng)用潛力巨大，有望成為未來新藥發(fā)展的主流方向之一。目前CGT治療領(lǐng)域以腫瘤和罕見病為主，逐漸向其他疾病領(lǐng)域拓展。根據(jù)Frost &Sullivan測算，全球CGT療法的市場規(guī)模有望在2025年達到305.4億美元，對應(yīng)2020-2025年CAGR高達71.2%。

CGT療法包括以免疫細胞治療、干細胞治療和其它體細胞治療為主的細胞療法，還包括以病毒為載體的基因替代和非病毒載體的基因編輯治療為主的基因療法。細胞與基因治療技術(shù)工藝路線主要包含三個方面：質(zhì)粒、病毒載體和細胞工廠，提升這三個方面的工藝開發(fā)技術(shù)、大規(guī)模生產(chǎn)能力，從而能夠更好地進行質(zhì)量控制和成本控制。然而在CGT藥物從早期研發(fā)、到成功上市需要經(jīng)歷多個階段，每個階段都存在極其復(fù)雜的不確定性，需要對其中多個關(guān)鍵點進行嚴(yán)格的質(zhì)量控制，從而確保最終產(chǎn)品的安全性和有效性。

圖1.CGT藥物研發(fā)及生產(chǎn)流程中翌圣質(zhì)控產(chǎn)品推薦

去除宿主細胞雜質(zhì)是細胞基因治療藥物在內(nèi)的生物制藥產(chǎn)品生產(chǎn)中的關(guān)鍵步驟，其中宿主細胞殘留DNA由于可能存在的免疫原性、感染性以及致瘤性等安全問題成為關(guān)鍵質(zhì)控指標(biāo)。在此情況下，建立合適的檢測方法監(jiān)測生產(chǎn)工藝，控制宿主細胞殘留核酸限度，以確保產(chǎn)品的安全性和質(zhì)量已經(jīng)成為監(jiān)管機構(gòu)和行業(yè)內(nèi)關(guān)注的重點。

• 《中國藥典》2020年版三部規(guī)定，以細胞基質(zhì)生產(chǎn)的生物制劑外源宿主細胞DNA殘留量不能超過100pg/劑，以細菌或真菌基質(zhì)（酵母、大腸桿菌等）表達的生物制品中DNA殘留量不超過10ng/劑；

• 《歐洲藥典》（EP10.0）通則規(guī)定的生物制品殘留DNA限度大多為不超過10ng/劑；

• 美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）發(fā)布的指導(dǎo)原則中指出生物制品宿主細胞DNA殘留限度不得超過100pg/劑，對于大劑量的生物制品（如單克隆抗體），根據(jù)其殘留DNA來源及給藥途徑，DNA殘留量可放寬至10ng/劑。

此外，《中華人民共和國藥典》2020年版第三部規(guī)定，外源性DNA殘留檢測采用DNA探針雜交法、熒光染色法和定量PCR法。目前市場上對宿主細胞殘留DNA檢測，主要采用熒光探針qPCR方法，qPCR法具有高的靈敏度、序列特異性和準(zhǔn)確性，可為生物制藥工業(yè)在工藝研究和成品質(zhì)量控制方面提供可靠的檢測手段，現(xiàn)也已成為各生物制品廠家檢測方法。

翌圣生物自主研發(fā)的E.coli宿主細胞殘留DNA的qPCR法檢測試劑盒，可快速高效檢測生物藥中宿主DNA殘留量。還研發(fā)了與之配套使用的宿主細胞殘留DNA樣本前處理試劑盒，以及配套的自動化核酸提取儀器。

圖2. E.coli DNA (2G)標(biāo)曲范圍30fg/μL~300pg/μL，R2=1，擴增效率為101.74%，各濃度檢測值CV<15%

除需對DNA的殘留量進行控制外，DNA殘留片段大小分布也是確定其相關(guān)風(fēng)險因素的重要指標(biāo)。有研究表明，一個功能基因至少在200bp以上，因此大于200bp可能會有一定的致病性，且殘留DNA片段越大，生物制品的風(fēng)險等級越高。

美國FDA在《Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs)》的行業(yè)指南中建議將非致瘤性連續(xù)細胞的殘留DNA量限制在10 ng/劑以下，DNA大小限制在約200bp以下。

2022年5月，國家藥品監(jiān)督管理局藥品評審中心（CDE）發(fā)布的體內(nèi)基因治療產(chǎn)品要學(xué)研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）中也明確指出需對DNA殘留量和殘留片段大小進行控制，建議盡量將DNA殘留片段的大小控制在200bp以下。

目前，行業(yè)內(nèi)對于殘留宿主細胞DNA片段分析，主要是利用毛細管電泳的方法。研究者們開發(fā)了一種基于毛細管凝膠電泳與敏感激光誘導(dǎo)熒光（CGE-LIF）檢測殘留DNA分子大小的方法，可以檢測生物制品中殘留DNA的大小，實驗表明，大多數(shù)宿主細胞殘留DNA片段大小為50～2 000bp。除了毛細管電泳法外，實時熒光定量PCR（qPCR）法也被用于進行生物制品中生產(chǎn)用細胞相關(guān)的DNA片段分布的分析。且qPCR法相比于CGE-LIF操作更簡單，耗時更短。

針對上述情況，翌圣生物自主研發(fā)了E.coli&HEK293殘留DNA片段分析試劑盒，采用熒光探針qPCR法原理，設(shè)計了四種不同的擴增片段（幾十bp、100多bp、200多bp、500多bp），用于定量檢測樣本中宿主細胞殘留DNA片段的大小分布情況。

圖3. 宿主細胞中殘留DNA片段分析檢測流程圖

據(jù)了解，各監(jiān)管機構(gòu)在判定DNA產(chǎn)品純度時，均會將宿主細胞殘留RNA（HCR）含量作為其中一項關(guān)鍵檢測指標(biāo)。

2022年5月，國家藥品監(jiān)督管理局藥品評審中心（CDE）發(fā)布的體內(nèi)基因治療產(chǎn)品要學(xué)研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）中也明確指出需對生產(chǎn)工藝引入的工藝相關(guān)雜質(zhì)，如宿主細胞RNA等納入產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進行控制。

美國FDA中明確規(guī)定了質(zhì)粒材料的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：超螺旋DNA＞85%，宿主細胞蛋白＜1%，殘留細菌DNA＜1%（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)測定），殘留細菌RNA＜1%（高效液相色譜法或凝膠法檢測不到）。

歐洲藥品管理局（EMA）在《基因治療藥物產(chǎn)品的質(zhì)量、非臨床和臨床方面的指導(dǎo)原則》中，提出應(yīng)考慮宿主細胞殘留RNA，以確定質(zhì)粒純度。

已知，對于生物制品的起始原材料質(zhì)粒DNA中的宿主菌RNA殘留檢測，通常采用20年版中國藥典0541通則瓊脂糖凝膠電泳法。此外，USP發(fā)布的《mRNA疫苗質(zhì)量分析方法-指南草案》(第二版)，對于質(zhì)粒DNA質(zhì)量屬性的測試中提到了：宿主細胞RNA檢測可采用高效液相色譜或瓊脂糖凝膠電泳法。

除了瓊脂糖凝膠電泳和高效液相色譜法外，行業(yè)內(nèi)還會采用定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-qPCR）和RNA熒光定量方法檢測生物制品中的宿主細胞殘留RNA。RT-qPCR法由于可實現(xiàn)對待測樣本中的殘留RNA專一性擴增和精確定量，而被廣泛應(yīng)用。

翌圣生物自主研發(fā)的E.coli殘留RNA檢測試劑盒可專一快速檢測樣本中E.coli殘留RNA。

生物制品中HCP殘留含量通常被認為是產(chǎn)品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性(CQA)，是工藝穩(wěn)健性監(jiān)測的重要評價指標(biāo)，也是產(chǎn)品的重要質(zhì)控指標(biāo)。各國法規(guī)都有涉及HCP的論述，要求必須對生物藥品進行分析和純化，以將宿主細胞蛋白HCP降低到可接受的水平。

《中國藥典》三部（2020版）規(guī)定：針對CHO細胞，HCP殘留需要<0.05%（相當(dāng)于小于500ppm）；針對E.coli，HCP殘留需要<0.01%。

美國藥典USP<1132>章節(jié)規(guī)定：用一種靈敏度較高的方法檢測藥品中的HCP，其含量應(yīng)該低于檢測限（通常小于100ppm，即1mg總蛋白中HCP含量應(yīng)小于100ng，也即<0.01%）。

酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）是目前HCP檢測常用的方法，在2020版《中國藥典》通則3412/3413/3414中提到的宿主蛋白殘留檢測方法均為ELISA法。

翌圣生物科技（上海）股份有限公司自主研發(fā)了包括CHO宿主細胞在內(nèi)的多款HCP蛋白殘留量檢測試劑盒。試劑盒均采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫檢測（ELISA）的實驗原理，以及生物素-鏈霉親和素放大系統(tǒng)，能夠高靈敏的檢測樣本中HCP殘留量。試劑盒可以用于生物制品純化工藝過程的優(yōu)化、中間工藝過程的雜質(zhì)控制以及終產(chǎn)品的放行檢測。

圖4. 翌圣HCP ELISA試劑盒產(chǎn)品特點

在治療性藥物（如抗體、病毒載體藥物等）的生產(chǎn)及工藝流程中，核酸雜質(zhì)的去除至關(guān)重要。UltraNuclease全能核酸酶，又稱為廣譜核酸酶、非限制性核酸內(nèi)切酶，其能夠在多種實驗條件下切割和降解各種形式的DNA和RNA，廣泛用于去除生物制品中的核酸。

在正常的純化步驟中，全能核酸酶作為雜質(zhì)很容易被去除。為檢測全能核酸酶具體殘留量，行業(yè)內(nèi)常采用UltraNuclease作為標(biāo)準(zhǔn)品，開發(fā)與之配套的ELISA試劑盒。

翌圣自主研發(fā)的UCF.ME® UltraNuclease ELISA Kit正是采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫檢測（夾心ELISA）原理，能夠準(zhǔn)確檢測樣本中全能核酸酶的殘留量，該試劑盒在線性、重復(fù)性、回收率及特異性等方面均表現(xiàn)穩(wěn)定。

圖5. 翌圣核酸酶ELISA試劑盒實驗原理（雙抗夾心ELISA法）

大多數(shù)應(yīng)用于細胞基因治療的病毒載體均被設(shè)計為復(fù)制缺陷型。對于復(fù)制缺陷型病毒載體，在生產(chǎn)中可能發(fā)生經(jīng)缺失改造的載體與野生型病毒序列之間的同源重組，導(dǎo)致產(chǎn)生復(fù)制型病毒，其中包括復(fù)制型慢病毒(RCL)、復(fù)制型逆轉(zhuǎn)錄病毒(RCR)和復(fù)制型腺相關(guān)病毒(rcAAV)。終產(chǎn)品中復(fù)制型病毒的存在有可能引起病人不良反應(yīng)，構(gòu)成臨床隱患和潛在危險，甚至引發(fā)腫瘤，故對復(fù)制型病毒檢測是安全性檢測中非常重要的項目。

隨著病毒載體在CGT領(lǐng)域應(yīng)用越來越廣泛，相關(guān)法規(guī)和技術(shù)原則對監(jiān)測復(fù)制型病毒提出了建議。

2022年CDE發(fā)布《體內(nèi)基因治療產(chǎn)品藥學(xué)研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》和《體外基因修飾系統(tǒng)藥學(xué)研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》都提到病毒載體制備工藝中，復(fù)制型病毒是安全性風(fēng)險關(guān)注點之一，應(yīng)采用經(jīng)驗證的方法開展檢測，如指示細胞培養(yǎng)法、直接qPCR法等。

2020年1月28日，F(xiàn)DA發(fā)布的《關(guān)于細胞與基因治療申請(INDs)的化學(xué)、制造和控制(CMC)指導(dǎo)原則》中提到：對于生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的RCA、RCR等，需要進行病毒收獲液、病毒原液、制劑等的檢測。

針對上述情況，翌圣生物自主研發(fā)了一系列復(fù)制型病毒（RCL/RCR/RCA/rcAAV）檢測試劑盒，基于熒光探針定量PCR原理，采用qPCR法特異性擴增對應(yīng)復(fù)制型病毒的序列，專一快速的檢測各種使用病毒載體相關(guān)的細胞基因治療產(chǎn)品中可能發(fā)生的復(fù)制型病毒的潛在風(fēng)險。

圖6.翌圣生物rcAAV-2復(fù)制型腺相關(guān)病毒檢測實驗流程

已知CAR-T和TCR-T細胞治療，均是將含有CAR或TCRαβ序列的目的基因構(gòu)建到慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，然后進行病毒感染T細胞，獲得CAR-T或TCR-T細胞。這些載體基因整合在T細胞基因組中，一方面顯示有T細胞進行了CAR或TCR基因修飾，一方面又是一個安全性指標(biāo)，可能會因整合而帶來原癌基因的激活或抑癌基因的失活等造成二次腫瘤的風(fēng)險。盡管現(xiàn)在載體的設(shè)計已經(jīng)大大降低了整合的風(fēng)險，但這種風(fēng)險仍未全消除，因此需要對整合到細胞基因組中的病毒載體拷貝數(shù)進行檢測。

針對CAR和TCR基因整合帶來的潛在風(fēng)險，國內(nèi)外的藥品監(jiān)管相關(guān)機構(gòu)都發(fā)布了相應(yīng)的指導(dǎo)性文件。

2018年6月，中國食品藥品檢定研究院頒發(fā)的《CAR-T細胞治療產(chǎn)品質(zhì)量控制檢測研究及非臨床研究考慮要點》明確規(guī)定CAR基因拷貝數(shù)≤5 copies/細胞。

目前，實時熒光定量PCR（qPCR）廣泛用于基因表達、拷貝數(shù)確定和病原體檢測研究等，這種方法可以準(zhǔn)確定量樣品中DNA或RNA的核酸靶序列數(shù)量。因此，CAR和TCR等轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的檢測行業(yè)內(nèi)也普遍采用qPCR的方法。

翌圣生物自主研發(fā)了CAR/TCR基因拷貝數(shù)檢測試劑盒，采用多重?zé)晒馓结榪PCR法分別檢測CAR-T或TCR-T細胞基因組中CAR或TCR基因的拷貝數(shù)以及人體細胞中單拷貝基因(Single Copy Gene, SCG)。

相較于傳統(tǒng)化學(xué)藥物，以基因治療、細胞治療或組織工程為基礎(chǔ)的新型生物治療業(yè)已成為前沿性治療藥物。這些藥物大多以細胞為載體制備或構(gòu)建，因此，在此過程中，對于細胞種子庫、病毒培養(yǎng)和收獲、臨床治療用途的細胞等生物制品中生產(chǎn)制備過程易受到支原體污染。

支原體是一種比較常見但通常難以去除的污染類型，對于涉及細胞培養(yǎng)的生物制品工藝過程，法規(guī)要求“必須確保無支原體污染”。目前國內(nèi)外藥典推薦的支原體檢測方法主要是基于培養(yǎng)法、NAT(核酸擴增法)法、細胞培養(yǎng)指示法。

翌圣生物MycAway®支原體qPCR檢測試劑盒（探針法）(2G)是基于NAT法的一種快速定性檢測生產(chǎn)原料、細胞庫、病毒種子、病毒或細胞收獲液、治療用細胞中潛在支原體污染的產(chǎn)品。該試劑盒基于定量PCR技術(shù)，使用Taqman熒光探針定性檢測待測樣本中支原體DNA，可覆蓋183種支原體DNA序列；并且嚴(yán)格按照EP 2.6.7和JP G3支原體檢測相關(guān)指南和要求進行驗證，具備靈敏度高、特異性好、安全性好等特點。該試劑盒還能夠與MolPure®磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒搭配使用，通過手動提取或者使用自動化核酸提取儀自動提取樣本核酸，再由qPCR收集探針的熒光信號，從而對檢測結(jié)果進行判定。

圖7.翌圣生物NAT法支原體qPCR檢測實驗流程