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CoIP實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)問(wèn)題

來(lái)源:愛(ài)必信(上海)生物科技有限公司   2024年09月03日 10:33  

免疫(共)沉淀(IP/CoIP)是基于抗體和蛋白的特異性親和作用,通過(guò)捕獲與蛋白或抗原特異性結(jié)合的抗體,進(jìn)而從復(fù)雜的樣品中捕獲及富集目標(biāo)蛋白,同時(shí)可以測(cè)定與之相互作用的蛋白或其它生物大分子。

 

CoIP原理圖

 

CoIP實(shí)驗(yàn)對(duì)照的設(shè)置方法

 

常見(jiàn)的主要有三種方式:

1)第一種是實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染誘餌蛋白和標(biāo)簽蛋白,對(duì)照組只轉(zhuǎn)染標(biāo)簽蛋白,這種方法不僅可以提高誘餌蛋白的表達(dá)量,增加實(shí)驗(yàn)的成功率,而且標(biāo)簽抗體的成本低,親和力強(qiáng),但是畢竟不是本身生理狀態(tài)下的表達(dá)量,和實(shí)際結(jié)果可能有出入,而且需要構(gòu)建載體,更適用于誘餌蛋白表達(dá)量低或者沒(méi)有IP抗體的情況;

2)第二種是選擇IP抗體的對(duì)照IgG抗體,這種方式下,誘餌蛋白的表達(dá)處于天然狀態(tài),更接近真實(shí)情況,但是相應(yīng)的可能出現(xiàn)表達(dá)量低,成功率不高的情況,同時(shí)需要IP級(jí)別的抗體;

3)第三種就是用敲除誘餌蛋白的細(xì)胞作對(duì)照樣本,這種情況下,實(shí)驗(yàn)組也是在天然條件下,可信度高,但是實(shí)驗(yàn)所需的周期較高,要進(jìn)行敲除驗(yàn)證。

 

1、CoIP試劑盒中樣本裂解液可以用WB的裂解液替代嗎?

不可以,CoIP的裂解液中一般不含SDS,SDS是一種強(qiáng)效的去垢劑,它能夠破壞蛋白質(zhì)之間的非共價(jià)相互作用,使蛋白質(zhì)變性,這會(huì)導(dǎo)致原本相互作用的蛋白質(zhì)復(fù)合體解離。

 

2、COIP樣本裂解后蛋白濃度一般能達(dá)到多少?

不低于1mg/mL,如果蛋白濃度過(guò)高,可用pbs稀釋。

 

3、瓊脂糖珠中Protein A和Protein G有何區(qū)別,都要加嗎?

一般建議都加,Protein A與兔源抗體親和力高,Protein G與鼠源抗體親和力高。


4、抗體、樣本、磁珠的加入順序比較?

第一種抗體先于蛋白結(jié)合,再加入磁珠,第二種抗體先與磁珠孵育,最后加入蛋白,第三種同時(shí)加入,一般情況下第一種與第二種相差不大,如果蛋白量過(guò)高,比如大于1000ug,建議使用第二種,否則蛋白容易吸附在磁珠上,降低得率。

 

5、Input組要跑內(nèi)參嗎?

當(dāng)然,Input組跑內(nèi)參不僅可以協(xié)助判斷操作,對(duì)樣本是否降解也有提示作用。

 

IP/CoIP結(jié)果判讀及常見(jiàn)問(wèn)題

 

1、CoIP結(jié)果如何判讀?

 

 

IB:即免疫印跡,也就是常規(guī)的Western Blotting,用于顯示目的蛋白;

IP:即免疫沉淀,這一步主要是為了純化富集目的蛋白;

Input:全細(xì)胞裂解液,含有細(xì)胞內(nèi)所有的蛋白,可認(rèn)為是陽(yáng)性組。也就是處理完樣本得到的細(xì)胞裂解液,在做IP實(shí)驗(yàn)之前,需要先跑WB,確認(rèn)樣本中含有蛋白A和蛋白B;

Anti-A:A蛋白的免疫共沉淀抗體;

IgG:Anti-A的同型對(duì)照抗體,即跟Anti-A同來(lái)源同種型,如Anti-A是兔來(lái)源IgG型,則同型對(duì)照抗體需要選擇Rabbit IgG(abs20035)。

 

結(jié)果圖解析

 

該結(jié)果是為驗(yàn)證蛋白A與蛋白B是否存在相互作用。本實(shí)驗(yàn)一共分為兩大組:Input組及IP組,其中IP組又分為IgG組(陰性對(duì)照組)和實(shí)驗(yàn)組,并通過(guò)WB去驗(yàn)證蛋白A和B在每一個(gè)組里面是否存在。由Input組的條帶可以得到結(jié)論:蛋白A與蛋白B都是存在的,證明樣本處理提取蛋白的步驟沒(méi)有任何問(wèn)題。陰性對(duì)照IgG組和實(shí)驗(yàn)組平行進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn),結(jié)果蛋白A與蛋白B均沒(méi)有條帶,說(shuō)明利用IgG抗體沒(méi)有把蛋白A和B沉淀下來(lái),證明蛋白A和B與IgG沒(méi)有結(jié)合,排除了蛋白與抗體非特異性結(jié)合的可能性;而實(shí)驗(yàn)組蛋白A和B均有條帶,表示利用蛋白A的抗體進(jìn)行沉淀實(shí)驗(yàn),成功把蛋白A沉淀下來(lái)了,與此同時(shí)蛋白B也被沉淀下來(lái),進(jìn)而得到結(jié)論:蛋白A與蛋白B之間存在相互作用。

 

2、input組無(wú)條帶,IP組有條帶

 

 

可能由于目標(biāo)蛋白在樣本中的豐度較低或存在降解現(xiàn)象,這導(dǎo)致在Input組中未能成功檢測(cè)到該蛋白,而在IP組經(jīng)過(guò)富集后能夠檢測(cè)到。建議適當(dāng)提高Input組的上樣量,進(jìn)行常規(guī)的WB驗(yàn)證,并在樣本處理階段添加蛋白酶抑制劑以穩(wěn)定蛋白質(zhì)。

 

3、雜帶問(wèn)題

 

非特異性條帶要分情況分析,如果是input和IP組、IgG組都有雜帶,可能是磁珠的非特異性結(jié)合,樣本上樣量過(guò)高、或者抗體濃度過(guò)高造成的非特異性結(jié)合,建議實(shí)驗(yàn)前對(duì)磁珠進(jìn)行漂洗,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中增加洗滌次數(shù),使用合適的樣品和抗體濃度。如果IgG組和IP組無(wú)雜帶,Input有雜帶,可能由于WB抗體的特異性不夠好,實(shí)際實(shí)驗(yàn)中可能考慮的因素可能要更多。

 

 

4、IP和IgG組均無(wú)條帶

 

可能由于IP抗體加入的量少,ip抗體特異性差,或者蛋白量過(guò)高,優(yōu)先覆蓋住beads,導(dǎo)致IP抗體和Beads的集合較少等,可以?xún)?yōu)先通過(guò)增加抗體用量和優(yōu)化結(jié)合順序入手,實(shí)在沒(méi)有改善只能更換抗體進(jìn)行嘗試。

 

 

5、輕重鏈問(wèn)題

 

 

在變性洗脫過(guò)程中,抗體在高溫和還原劑的影響下分解為重鏈55KD和輕鏈分子25KD,當(dāng)WB所用的抗體和IP抗體同源時(shí),二抗就會(huì)識(shí)別到IP抗體的輕重鏈,這是比較常見(jiàn)的一個(gè)問(wèn)題,在抗體選擇時(shí),盡量IP抗體和WB抗體來(lái)自不同種屬,當(dāng)然,即便已經(jīng)做了這種優(yōu)化,實(shí)驗(yàn)結(jié)果往往還是有輕重鏈,可能是由于二抗的特異性不夠等原因,這種情況下可以采用IP專(zhuān)用的二抗,這種抗體只識(shí)別輕鏈或者重鏈,如果目的蛋白在輕鏈附近,選擇只識(shí)別重鏈的抗體,或者對(duì)于WB實(shí)驗(yàn),建議使用直標(biāo)一抗,但需注意直標(biāo)一抗可能因無(wú)二抗信號(hào)放大作用,而導(dǎo)致信號(hào)較弱或無(wú)法曝光的情況。

 

注:本文圖片來(lái)源于網(wǎng)絡(luò),僅供學(xué)習(xí)參考用

 

相關(guān)產(chǎn)品


貨號(hào)

品名

規(guī)格

abs955

免疫(共)沉淀(IP/CoIP)試劑盒

50T

abs9649

免疫(共)沉淀(IP/CoIP)試劑盒(磁珠法)

10T/50T

abs9146

PMSF

5g/25g/100g

abs20035

Rabbit IgG

10mg

abs20038

Mouse IgG

1mg

abs9232

BCA蛋白定量試劑盒

500T/2500T

abs9301

預(yù)制膠(10%,10wells)

5片/盒

abs924

預(yù)染蛋白marker, 10-180kDa

250uL/250uL×2

abs950

10*電轉(zhuǎn)液

100mL/1L

abs954

WB專(zhuān)用一抗二抗稀釋液

100mL

abs961

10×PBS緩沖液

500mL

abs952

TBST(10×)

500mL×2

abs920

ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒

250mL×2




 

Absin產(chǎn)品線:

爆款產(chǎn)品:試劑盒(mIHC、IHC、凋亡、ELISA、ChIP、Co-IP、TR-FRET、生化檢測(cè)、殘留檢測(cè)、多因子檢測(cè));細(xì)胞培養(yǎng)(類(lèi)器官試劑盒+基質(zhì)膠,胎牛血清+培養(yǎng)添加劑+細(xì)胞因子)、分化試劑盒;分子(mRNA合成服務(wù)+提取試劑盒);化合物大包裝;輔助試劑、耗材/儀器、定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測(cè))...

特色產(chǎn)品:雞胚提取物CEE、B27、N2、霍亂毒素B亞單位CTB、牛腦垂體提取物BPE、百日咳毒素PTX、重組人胰島素Insulin、人源低密度脂蛋白LDL...

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