應(yīng)用簡(jiǎn)介
      腫瘤細(xì)胞/癌細(xì)胞的耐藥性是腫瘤/癌癥難以gen治的重要原因。體外構(gòu)建的耐藥細(xì)胞株，能模擬腫瘤細(xì)胞/癌細(xì)胞對(duì)特異藥物耐藥性的形成過(guò)程，有助于人們理解腫瘤細(xì)胞/癌細(xì)胞獲得耐藥性的機(jī)制，篩選獲得抗耐藥性的特異藥物，并對(duì)相關(guān)疾病進(jìn)行有針對(duì)性地臨床治療。
原理介紹
      一種藥物作用于某類(lèi)細(xì)胞后，會(huì)殺死其中沒(méi)有抗性的細(xì)胞，而這類(lèi)細(xì)胞中具有抗性的細(xì)胞不會(huì)被殺死，即進(jìn)行了選擇。具有抗性的細(xì)胞大量繁殖產(chǎn)生很多抗性后代，再用這種藥物時(shí)表現(xiàn)出的藥效大大下降的現(xiàn)象就是細(xì)胞的耐藥性。采用體外低濃度梯度遞增聯(lián)合大劑量間斷沖擊方法誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對(duì)特定藥物產(chǎn)生耐藥性，從而構(gòu)建出對(duì)特定藥物產(chǎn)生耐藥性的腫瘤細(xì)胞株。
實(shí)驗(yàn)方法
      一、檢測(cè)親本細(xì)胞株的IC50IC50(halfmaximalinhibitoryconcentration),即半抑制濃度,指某一種物質(zhì)對(duì)某些生物程序抑制達(dá)到50%抑制效果時(shí)的濃度。對(duì)細(xì)胞增殖方面,可以理解為對(duì)細(xì)胞增殖的抑制效果達(dá)到細(xì)胞正常增殖水平50%時(shí)的藥物濃度。通常用IC50來(lái)衡量藥物對(duì)細(xì)胞的毒性或者細(xì)胞 對(duì)藥物的耐受能力,在藥物實(shí)驗(yàn)中,常用IC50來(lái)評(píng)估實(shí)驗(yàn)中使用的藥物濃度。IC50的計(jì)算方法很多,常用的有Excel、graphpadprism、SPSS等。
      二、藥物濃度遞增法/大劑量藥物沖擊法
      1、大劑量間隙作用：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，生長(zhǎng)至70%～80%匯合時(shí)，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞置于含有濃度的藥物濃度的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液，PBS清洗2遍，更換不含藥物培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞恢復(fù)生長(zhǎng)，培養(yǎng)一段時(shí)間后更換不含藥物的RPMI-1640（DMEM）胎牛血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)、進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，傳代兩次，再將篩選出的細(xì)胞在濃度的藥物濃度培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)依這樣不斷改變作用時(shí)間，共經(jīng)過(guò)1h、2h、3h、6h、12h、24h、36h、48h、60h、72h共10個(gè)作用時(shí)間段，約8個(gè)月的培養(yǎng)，終使得細(xì)胞能夠在一定濃度的藥物的培養(yǎng)液中持續(xù)穩(wěn)定生長(zhǎng)并傳代，然后脫藥培養(yǎng)1個(gè)月在檢測(cè)細(xì)胞的生物特性及耐藥指標(biāo)。

2、濃度梯度遞增間隙作用：采用藥物濃度遞增培養(yǎng)法沖擊誘導(dǎo)，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞處于60～70%濃度對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)時(shí)，加入起始濃度為低濃度的藥物作用24h，棄去培養(yǎng)液，PBS清洗2遍，更換不含藥物培養(yǎng)基，細(xì)胞恢復(fù)生長(zhǎng)后，消化傳代復(fù)以低濃度作用細(xì)胞24h，待細(xì)胞增殖至正常形態(tài)后，重復(fù)上述藥物沖擊，每種濃度沖擊8次。待細(xì)胞在此濃度穩(wěn)定生長(zhǎng)后，提高藥物濃度繼續(xù)培養(yǎng)，藥物依次遞增濃度加藥。藥物誘導(dǎo)歷時(shí)大約9個(gè)月，直到細(xì)胞能夠在濃度的藥物中穩(wěn)定生長(zhǎng)。
      三、檢測(cè)耐藥細(xì)胞株的IC50。
      根據(jù)IC50值計(jì)算出耐藥指數(shù)（resistanceindex,RI），RI=耐藥細(xì)胞系的IC50/親代細(xì)胞系的IC50，RI>5則認(rèn)為耐藥細(xì)胞系的耐藥性符合耐藥株的要求。