應(yīng)用簡(jiǎn)介
       細(xì)胞凋亡是細(xì)胞主動(dòng)實(shí)施的一種程序性死亡，是細(xì)胞的基本特征之一，它在機(jī)體的胚胎發(fā)育、組織修復(fù)、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定等方面起著十分重要的作用。在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜中的磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。
技術(shù)原理
       AnnexinⅤ是一種分子量為35-36kD的Ca2+依賴(lài)性磷脂結(jié)合蛋白，能與細(xì)胞凋亡過(guò)程中翻轉(zhuǎn)到膜外的PS高親和力特異性結(jié)合。因此AnnexinV作為檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。將AnnexinⅤ進(jìn)行熒光素FITC標(biāo)記，以標(biāo)記了的AnnexinV作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。碘化丙錠（PropidiumIodide,PI）是一種核酸染料，它不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但對(duì)凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過(guò)細(xì)胞膜使細(xì)胞核染紅。因此將AnnexinV與PI匹配使用，就可以將處于不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。
基本特征：
       細(xì)胞凋亡具有特定形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)特征：
       1、形態(tài)學(xué)特征：凋亡常發(fā)生于單個(gè)細(xì)胞，其形態(tài)變化分3個(gè)階段：第一階段可見(jiàn)凋亡細(xì)胞與相鄰細(xì)胞分離，細(xì)胞皺縮，染色質(zhì)濃縮，聚集于核膜周?chē)拾朐滦?，亦可發(fā)生核斷裂，核仁裂解。第二階段可見(jiàn)細(xì)胞表面突出，分成多個(gè)膜包繞小體，含有部分核和／或完整的細(xì)胞器，稱(chēng)為凋亡小體（apoptosisbodies）。第三階段，凋亡小體被組織細(xì)胞或吞噬細(xì)胞吞噬降解。在有內(nèi)皮的腔中如膽管、凋亡小體可以排入腔內(nèi)；在組織培養(yǎng)中，凋亡細(xì)胞與鄰近細(xì)胞和培養(yǎng)基質(zhì)相分離。整個(gè)凋亡過(guò)程在幾小時(shí)內(nèi)全部完成。與壞死相比，凋亡的顯著特點(diǎn)是整個(gè)過(guò)程中漿膜保持完整，減少了細(xì)胞成分外漏，因此，沒(méi)有或僅有很輕炎癥反應(yīng)。而壞死是病理因素作用使細(xì)胞膜失去完整性而引起細(xì)胞溶解，通常波及相鄰細(xì)胞，表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹，細(xì)胞器溶解，細(xì)胞膜破裂，伴有組織炎癥。由于凋亡過(guò)程迅速，凋亡小體較小，因此，在光鏡下不易發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡。
       2、生物化學(xué)特征：細(xì)胞凋亡的生物化學(xué)特征是DNA斷裂，這種斷裂不是隨機(jī)的，它與細(xì)胞內(nèi)核酸內(nèi)切酶的激活有關(guān)。在內(nèi)切酶作用下，細(xì)胞核中的DNA裂解成核小體大小的片段，每個(gè)核苷酸片段大約有180～200個(gè)堿基對(duì)。在瓊脂糖凝膠電泳上出現(xiàn)典型的階梯樣的DNA區(qū)帶。而壞死的細(xì)胞，DNA被溶酶體釋放的多種水解酶隨機(jī)降解，DNA電泳呈模糊、微弱的蹤跡，不能形成階梯狀，以此可區(qū)別細(xì)胞凋亡和壞死。但是核小體斷裂是凋亡的晚期表現(xiàn)，并不普遍存在。
實(shí)驗(yàn)方法

注意事項(xiàng)
1、誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)間要準(zhǔn)確。
2、AnnexinV是光敏物質(zhì)，在操作時(shí)要注意避光。
3、細(xì)胞凋亡是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程，反應(yīng)一小時(shí)后熒光強(qiáng)度就開(kāi)始衰變，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞時(shí)，由于熒光易碎滅，觀察時(shí)要盡量快。
4、整個(gè)操作過(guò)程動(dòng)作要盡量輕柔，切勿用力吹打細(xì)胞，盡量在4℃下操作。