免疫印跡(Western blot)檢測(cè)科研實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)介紹
應(yīng)用簡(jiǎn)介
蛋白質(zhì)免疫印跡法(WesternBlot),簡(jiǎn)稱WB,是指通過SDS-PAGE膠將不同分子量的蛋白質(zhì)分離開,然后將目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)移到載體(PVDF)膜上,利用抗原抗體的特異性結(jié)合,用特異性的一抗結(jié)合目標(biāo)蛋白,用HRP標(biāo)記的二抗結(jié)合一抗,再加以ECL發(fā)光液顯色,檢測(cè)組織或者細(xì)胞內(nèi)某種或者某些特異性蛋白質(zhì)的表達(dá)。蛋白質(zhì)免疫印跡是做蛋白質(zhì)分析的一種常規(guī)技術(shù),常用于鑒定某種蛋白,并能對(duì)蛋白進(jìn)行定性和半定量分析,還可以用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-DNA、蛋白質(zhì)-RNA相互作用后續(xù)分析。WB技術(shù)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于蛋白水平的表達(dá)研究、抗體活性檢測(cè)和疾病早期診斷等多個(gè)研究領(lǐng)域。
技術(shù)原理
通過SDS-PAGE凝膠將細(xì)胞或生物樣品內(nèi)的蛋白按照蛋白分子量從大到小規(guī)律分離開。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品,轉(zhuǎn)移到固相載體(例如硝酸纖維素薄膜或PVDF膜)上,固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì),且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原,與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng),再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)(目前主要用HRP標(biāo)記的第二抗體),經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分(目前主要使用魯米諾和二抗中的HRP反應(yīng)發(fā)出熒光,通過儀器或者膠片顯色)。該技術(shù)廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)。
實(shí)驗(yàn)方法

常見問題
1、WB有什么優(yōu)點(diǎn)?
靈敏,可達(dá)ng級(jí),用ECL顯色法可達(dá)pg級(jí)。靈敏,相對(duì)便宜且特異性高。
2、細(xì)胞提取液有的有沉淀,有的很清亮,為什么呢?
有沉淀可能因?yàn)榈鞍讻]有變性wan全,可以適當(dāng)提高SDS的濃度,同時(shí)將樣品煮沸時(shí)間延長(zhǎng),一般需96℃以上10-15min左右;也不排除抗原濃度過高,這時(shí)需再加入適量上樣緩沖液。
3、膠片背景很臟,有什么解決方法?
減少抗原上樣量,降低一抗?jié)舛?,改變一抗孵育時(shí)間和溫度(盡量4℃過夜,此孵育條件比37℃1h要溫和很多),并提高封閉液濃度。
4、目標(biāo)帶是空白,周圍有背景,是為什么?
一抗?jié)舛容^高,二抗上HRP催化活力太強(qiáng),同時(shí)顯色底物處于一個(gè)臨界點(diǎn),反應(yīng)時(shí)間不長(zhǎng),將周圍底物催化完,形成了空白即“反亮現(xiàn)象”。將一抗和二抗?jié)舛冉档?,或更換新進(jìn)口的顯色底物。
5、電泳中常出現(xiàn)的一些現(xiàn)象:
①“︶”條帶呈笑臉狀
原因:凝膠不均勻冷卻,中間冷卻不好;電泳系統(tǒng)溫度偏高,而且電場(chǎng)強(qiáng)度太大(電泳的電場(chǎng)大致呈現(xiàn)U形,所以因?yàn)橼s時(shí)間而加大電壓可能會(huì)出現(xiàn)這個(gè))。
②“︵”條帶呈皺眉狀
原因:可能是由于裝置不合適,特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡,或者兩邊聚合不wan全。
③條帶拖尾
原因:樣品溶解不好,或存在一定程度地蛋白降解。
④紋理(縱向條紋)
原因:樣品中含有不溶性顆粒,可能抽提蛋白時(shí)出了問題。
⑤條帶偏斜
原因:電極不平衡或者加樣位置偏斜,一定要子平面臺(tái)子上電泳,膠要做好。
⑥條帶兩邊擴(kuò)散
原因:加樣量過多,彌散至孔周圍了,減少上樣量或者使用5X上樣緩沖液。
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