稀釋前將Ceturegel®基質(zhì)膠和適量體積的DMEM/F12放入4度冰箱過(guò)夜融化。

將凍存管內(nèi)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含3~4ml的H9全培養(yǎng)液的15ml離心管內(nèi)，以1000rpm，離心5min。

離心后將上清液吸除，輕彈離心管底，使細(xì)胞沉淀松散，加入新鮮的H9全培養(yǎng)液2~3ml，輕輕吹打一次使細(xì)胞克隆塊懸浮。

轉(zhuǎn)移至已經(jīng)鋪好Ceturegel®基質(zhì)膠的6孔板中培養(yǎng)。

復(fù)蘇第二天不換液，第三天起每天更換H9細(xì)胞全培養(yǎng)液。

注意：復(fù)蘇時(shí)不能吹打過(guò)度，不能吹打成單細(xì)胞，保持細(xì)胞克隆塊狀，復(fù)蘇后48小時(shí)換液，期間最好不要挪動(dòng)細(xì)胞。H9復(fù)蘇后可能4~5天才開(kāi)始有克隆出現(xiàn)，7-10天傳代（具體視克隆密度和大小而定）。

一般在復(fù)蘇后第7~10天傳代，之后常規(guī)傳代為6-7天一次。

在顯微鏡下觀察，直至克隆脫落（一般需要3~6min）。

將帶有脫落克隆的消化液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，放置一會(huì)，待克隆自然沉降后將上層吸除，加入H9全培養(yǎng)液3ml輕輕混勻，放置一會(huì)，待克隆自然沉降后將上層培養(yǎng)液吸除，重復(fù)一次（即H9全培養(yǎng)液漂洗2遍，沉降后吸掉上清）。

加入H9全培養(yǎng)液3ml，用1ml移液器吹打2-3次，將克隆塊吹散成大小為原來(lái)的約1/10（若想得到大小較均一的克隆塊，此時(shí)可將細(xì)胞靜置片刻，待細(xì)胞自然沉降后取懸浮于液體中間層的克隆塊傳代），傳代比例根據(jù)母瓶克隆密度和大小而定，一般1:3~1:5傳代。

放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

第二天不換液，第三天起每天換液，換液前顯微鏡下將分化的克隆挑除。

注意：傳代時(shí)不能吹打過(guò)度，不能吹打成單細(xì)胞，保持細(xì)胞克隆塊狀，傳代后48小時(shí)換液，期間最好不要挪動(dòng)細(xì)胞。每6~7天傳代一次。