1. PCR擴(kuò)增

PCR-SBT技術(shù)首先是對待測DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以擴(kuò)增出分型區(qū)域。PCR，即聚合酶鏈反應(yīng)，是一種在體外快速擴(kuò)增特定DNA片段的方法。在PCR過程中，需要設(shè)計(jì)特定的引物，它們能夠與待擴(kuò)增的DNA片段兩端互補(bǔ)結(jié)合。然后，在DNA聚合酶的作用下，以dNTP為原料，按照堿基互補(bǔ)配對的原則，合成新的DNA鏈。通過多次循環(huán)的變性、退火和延伸步驟，待測DNA片段得以大量擴(kuò)增。

在PCR-SBT技術(shù)中，為了擴(kuò)增出HLA基因的多態(tài)性區(qū)域，通常需要設(shè)計(jì)多個(gè)引物對。這些引物對能夠覆蓋HLA基因的所有可變位點(diǎn)，確保擴(kuò)增出所有可能的等位基因。通過PCR擴(kuò)增，可以得到大量含有不同等位基因序列的DNA片段。

SYBR GreenⅠ染料法原理示意圖

2. 序列反應(yīng)

PCR擴(kuò)增后的DNA片段需要進(jìn)行測序，以確定它們的具體序列。在PCR-SBT技術(shù)中，一般采用Sanger測序技術(shù)，也被稱為雙脫氧測序法。這種測序方法基于DNA合成過程中的鏈終止反應(yīng)。在測序反應(yīng)中，向PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入四種熒光標(biāo)記的雙脫氧核苷酸（ddNTP），它們與正常的dNTP在結(jié)構(gòu)上相似，但缺少一個(gè)羥基，因此不能繼續(xù)參與DNA鏈的合成。當(dāng)DNA聚合酶在合成過程中遇到ddNTP時(shí)，鏈的合成就會(huì)終止。由于ddNTP的熒光標(biāo)記不同，因此可以通過熒光檢測器區(qū)分出不同的終止位置，從而確定DNA序列。

3. 數(shù)據(jù)分析

測序得到的數(shù)據(jù)需要進(jìn)行進(jìn)一步的分析和比對。首先，需要對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行整合和預(yù)處理，確定每個(gè)可變位點(diǎn)的基因型組成，包括去除低質(zhì)量的序列、拼接重疊的序列片段等。然后，將新測定的基因型與已知的HLA等位基因序列進(jìn)行比對，以確定其種屬和亞種。這一步驟需要借助專業(yè)的數(shù)據(jù)庫和軟件工具，如IMGT/HLA數(shù)據(jù)庫等。通過比對分析，可以準(zhǔn)確地確定待測樣本的基因型別。

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