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qPCR的CT值為何定在15-35之間?

來源:天津益元利康生物科技有限公司   2024年10月17日 16:59  

一、擴增曲線

擴增曲線是描述PCR動態(tài)進程的曲線,擴增曲線一般以循環(huán)數(shù)(Cycle number)為橫坐標(biāo),熒光強度(Fluorescence intensity)或信號量(Signal amount)為縱坐標(biāo)。典型的擴增曲線可以分成四個時期:基線期、指數(shù)期、線性期和平臺期。

基線期:擴增曲線的水平部分,通常在PCR反應(yīng)的前幾個循環(huán)(3-15個循環(huán))內(nèi)。此階段擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物生成量的變化。儀器軟件會基于這階段的熒光信號計算出基線范圍。

指數(shù)期:PCR擴增的指數(shù)增長階段,擴增曲線起峰。此時期所有反應(yīng)試劑均有盈余,DNA聚合酶保持高水平的活力,每個循環(huán)的產(chǎn)物量與初始模板量符合指數(shù)關(guān)系。這是進行定量分析的最佳時期,因為PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系。

線性期:隨著原料的消耗、產(chǎn)物的積累、酶活的損耗等,DNA的擴增不再呈指數(shù)擴增,熒光信號的增長也逐漸放緩,反應(yīng)效率降低。產(chǎn)物量與初始模板量不再符合指數(shù)關(guān)系。

平臺期:由于底物耗盡、酶活性降低等因素,熒光信號不再增加,趨于平穩(wěn)。每個反應(yīng)進入平臺期的時間和平臺期的高低各不相同。

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、熔解曲線

熔解曲線(Dissociation curve)是隨溫度升高DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)降解程度的曲線。它用于分析PCR產(chǎn)物的濃度、特點和純度。

原理:PCR反應(yīng)結(jié)束后,通過逐漸增加溫度同時監(jiān)測每一步的熒光信號來產(chǎn)生熔解曲線。隨著溫度上升,DNA雙鏈逐漸解開,熒光染料從雙鏈中釋放出來,熒光信號降低。當(dāng)溫度達到DNA雙鏈解鏈50%時,對應(yīng)的溫度稱為熔解溫度(Tm)。

曲線分析:

單峰曲線:如果qPCR產(chǎn)物非常特異,熔解曲線在80-90℃之間會形成一個單峰。這表明只擴增到了目的基因,沒有非特異性擴增產(chǎn)物。

前置雜峰:在主峰前有一個前鋒,可能是比目的片段短些的非特異性片段,在溫度低一些的時候就能解開雙鏈,也可能是引物二聚體。

后置雜峰:躲在主峰后面的是比目的片段長些的非特異性片段,在溫度高一些的時候才能解開雙鏈。

寬峰:如果非特異性產(chǎn)物Tm值與目的條帶的Tm值接近,熔解曲線可能出現(xiàn)寬峰。

擴增循環(huán)數(shù)(Cycle Threshold,Ct)在qPCR(實時熒光定量PCR)中是一個關(guān)鍵參數(shù),代表PCR擴增過程中,熒光信號達到設(shè)定的熒光閾值時所對應(yīng)的擴增循環(huán)數(shù)。

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三、Ct值的定義

Ct值:全稱為Cycle Threshold,即在PCR反應(yīng)中,每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。簡單來說,就是熒光信號開始由本底進入指數(shù)增長階段的拐點所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。

Ct值的意義與范圍

Ct值與模板量的關(guān)系:衡量PCR擴增過程中熒光信號達到設(shè)定閾值的循環(huán)次數(shù)。? Ct值越小,表示樣本中靶標(biāo)核酸的起始拷貝數(shù)越多;Ct值越大,則表示起始拷貝數(shù)越少?Ct值與起始模板量的對數(shù)存在線性關(guān)系。

Ct值的范圍:在正常情況下,Ct值的范圍通常在15-35之間。Ct值小于15可能意味著擴增在基線期范圍內(nèi),未達到熒光閾值;而Ct值大于35則可能意味著模板起始拷貝數(shù)過低,擴增效率不佳或存在非特異性擴增,結(jié)果無意義。

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