無細胞蛋白質合成（CFPS）是一個易于使用、快速且高效的系統(tǒng)，它不包含膜結構障礙，但包含了原生細胞的轉錄和翻譯機制以及合成所需蛋白質的外源資源（例如，氨基酸、核苷酸和二級能量底物）。1-5

CFPS（大腸桿菌）套件可以在幾小時內產生高水平和不同分子量的重組蛋白，并且可以用于高通量功能基因組學和蛋白質組學。此外，它還可以提供蛋白質以推動生化和結構生物學研究。

合成的蛋白質可以通過SDS-PAGE、西方印跡和熒光檢測尺寸排除色譜（FSEC）進行檢測，并且可以通過親和純化技術從反應混合物中分離出來，以進行進一步的結構和/或功能特性分析。

艾美捷Cayman Chemical無細胞蛋白質合成（大腸桿菌）試劑盒：

貨號：41534

同義詞：CFPS（無細胞蛋白質合成）

儲存：-80°C

運輸：在美國本土使用干冰運輸；其他地區(qū)可能有所不同

穩(wěn)定性：至少1年

模板制備：

包含DNA的線性或環(huán)形質粒或用于POl的PCR產物可以用作模板。環(huán)形質粒DNA可以產生相對較高的產量，但在進行高通量篩選時使用PCR產物更為方便。為了獲得最佳的蛋白質產量，使用高純度和高濃度的質粒DNA模板非常重要，并避免在DNA模板中加入高濃度的鹽或甘油。此外，建議在蛋白質合成緩沖液中添加適當的核酸酶抑制劑，以抑制任何污染的RNase/DNase并穩(wěn)定線性DNA。為了方便，可以使用Control His-sfGFP Plasmid（產品編號400793）作為克隆載體。這個高拷貝數載體包含了所需的T7啟動子、核糖體結合位點（RBS）和T7終止子元素。sfGFP基因可以被其他感興趣的基因替換，以用于體外表達。

環(huán)形質粒DNA作為模板

在此平臺上使用的質粒必須包含以下元素和結構特征：

圖：控制His-sfGFP質粒的示意圖

目標基因必須位于一個RBS（核糖體結合位點）上游的T7啟動子的控制之下。

T7啟動子與ATG起始密碼子之間的距離應在20到100個核苷酸左右。

T7終止子必須位于終止密碼子下游。

文獻參考：

1. Silverman, A.D., Karim, A.S., and Jewett, M.C. Cell-free gene expression: An expanded repertoire of applications. Nat. Rev. Genet. 21(3), 151-170 (2020).

2. Garenne, D., Haines, M.C., Romantseva, E., et al. Cell-free gene expression. Nat. Rev. 1, 49 (2021).

3.Levine,M.Z.,Gregprio,N.E.,Jewett,M.C.,et al.Escherichia coli-basedcell-free protein synthesis:Protocols for a robust flexible,and accessibleplatform technology.J.Vis.Exp.144,e58882(2019).

4. Jewett, M.C., and Swartz, J.R. Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis. Biotechnol. Bioeng. 86(1), 19-26 (2004).

5. Davanloo, P., Rosenberg, A.H., Dunn, J.J., et al. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 81(7), 2035-2039 (1984).

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