一、引言

南荻（Miscanthus lutarioriparius）作為一種重要的多年生高大禾本科植物，在生物質(zhì)能源、造紙、紡織等領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。其具有生物量大、纖維素含量高、適應(yīng)性強等優(yōu)良特性，是理想的可再生能源原料之一。然而，傳統(tǒng)的南荻品種改良方法存在周期長、效率低等局限性，難以滿足現(xiàn)代生物質(zhì)產(chǎn)業(yè)對南荻優(yōu)良品種的需求。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，建立南荻遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)成為突破這一瓶頸的關(guān)鍵。通過遺傳轉(zhuǎn)化，可以將有益基因?qū)肽陷?，實現(xiàn)對其性狀的精準(zhǔn)改良，從而提高南荻的利用價值，促進相關(guān)產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

二、材料與方法

（一）植物材料

采集野生或栽培的健康南荻成熟種子、幼嫩莖段和葉片作為外植體材料。將采集的材料用清水沖洗干凈，去除表面的雜質(zhì)和灰塵，然后在 70% 的乙醇溶液中浸泡 30 - 60 秒，再用含有 0.1% - 0.2% HgCl?的消毒液浸泡 8 - 12 分鐘，最后用無菌水沖洗 3 - 5 次，備用。

（二）培養(yǎng)基的配制

誘導(dǎo)培養(yǎng)基

以 MS 基本培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加 2,4 - D（2 - 4mg/L）、6 - BA（0.5 - 1mg/L）、蔗糖（30g/L）和瓊脂（7g/L），pH 調(diào)至 5.8 - 6.0。該培養(yǎng)基用于誘導(dǎo)外植體產(chǎn)生愈傷組織。

繼代培養(yǎng)基

MS 培養(yǎng)基添加 NAA（0.5 - 1mg/L）、KT（0.2 - 0.5mg/L）、蔗糖（30g/L）和瓊脂（7g/L），pH 5.8 - 6.0。用于愈傷組織的繼代培養(yǎng)，保持愈傷組織的生長狀態(tài)和增殖能力。

分化培養(yǎng)基

MS 培養(yǎng)基中加入 6 - BA（1 - 2mg/L）、IAA（0.5 - 1mg/L）、蔗糖（30g/L）和瓊脂（7g/L），pH 5.8 - 6.0。促使愈傷組織分化形成芽。

生根培養(yǎng)基

1/2MS 培養(yǎng)基，添加 IBA（0.5 - 1mg/L）、蔗糖（20g/L）和瓊脂（7g/L），pH 5.8 - 6.0。用于誘導(dǎo)芽生根，形成完整的植株。

（三）愈傷組織的誘導(dǎo)

種子誘導(dǎo)

將消毒后的南荻種子接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在溫度為 25 ± 2℃、光照強度為 1500 - 2000lx、光照時間為 12 - 16 小時 / 天的條件下培養(yǎng)。觀察種子萌發(fā)和愈傷組織的產(chǎn)生情況，一般在培養(yǎng) 2 - 3 周后開始出現(xiàn)淡黃色、質(zhì)地疏松的愈傷組織。

莖段和葉片誘導(dǎo)

將消毒后的莖段和葉片切成約 0.5 - 1cm 的小段或小塊，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。培養(yǎng)條件同種子誘導(dǎo)，但莖段和葉片誘導(dǎo)愈傷組織的時間可能稍長，約 3 - 4 周，且不同外植體的誘導(dǎo)率有所差異。對誘導(dǎo)出的愈傷組織根據(jù)其質(zhì)地、顏色等特征進行篩選，選擇生長旺盛、質(zhì)地疏松且顏色均勻的愈傷組織用于后續(xù)培養(yǎng)。

（四）農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化

農(nóng)桿菌菌株及載體構(gòu)建

選用合適的農(nóng)桿菌菌株（如 LBA4404），將目的基因構(gòu)建到含有合適啟動子（如 CaMV35S 啟動子或南荻自身的強啟動子）和篩選標(biāo)記基因（如潮霉素抗性基因）的雙元載體上。通過電擊轉(zhuǎn)化或熱激轉(zhuǎn)化等方法將構(gòu)建好的載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌中。

共培養(yǎng)

將處于對數(shù)生長期的農(nóng)桿菌菌液離心收集，用液體 MS 培養(yǎng)基重懸至 OD??? = 0.5 - 0.8。將篩選好的南荻愈傷組織浸泡在農(nóng)桿菌菌液中 10 - 20 分鐘，然后取出用無菌濾紙吸干多余菌液，接種到共培養(yǎng)培養(yǎng)基上（MS 培養(yǎng)基添加乙酰丁香酮 100 - 200μM），在黑暗條件下 22 - 25℃共培養(yǎng) 2 - 3 天。

篩選培養(yǎng)

共培養(yǎng)結(jié)束后，將愈傷組織用含有頭孢噻肟鈉（200 - 500mg/L）的無菌水沖洗 3 - 5 次，以去除表面多余的農(nóng)桿菌。然后將愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有篩選劑（如潮霉素，根據(jù)預(yù)實驗確定合適濃度，一般為 20 - 50mg/L）的篩選培養(yǎng)基（繼代培養(yǎng)基中添加篩選劑）上進行篩選培養(yǎng)。每 2 - 3 周更換一次培養(yǎng)基，持續(xù)篩選 2 - 3 個月，直至獲得穩(wěn)定的抗性愈傷組織。

（五）再生植株的獲得與鑒定

分化與生根

將篩選得到的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，在光照條件下培養(yǎng)，促進芽的分化。待芽長至 2 - 3cm 時，將其切下轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，形成完整的再生植株。

分子鑒定

采用 PCR 技術(shù)對再生植株進行初步鑒定，以目的基因特異性引物和篩選標(biāo)記基因引物進行擴增，檢測目的基因是否整合到南荻基因組中。對于 PCR 陽性植株，進一步采用 Southern blotting 分析目的基因的拷貝數(shù)，以及 Northern blotting 或?qū)崟r定量 PCR 檢測目的基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況，確保目的基因在南荻中穩(wěn)定表達(dá)且發(fā)揮預(yù)期功能。

三、結(jié)果

（一）愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果

通過不同外植體和不同培養(yǎng)基的組合實驗，發(fā)現(xiàn)種子和幼嫩莖段在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的愈傷組織誘導(dǎo)率較高，分別可達(dá) 70% - 80% 和 60% - 70%，而葉片的誘導(dǎo)率相對較低，約為 40% - 50%。誘導(dǎo)出的愈傷組織在繼代培養(yǎng)基上能夠保持良好的生長狀態(tài)，經(jīng)過多次繼代后仍具有較高的增殖能力。

（二）遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果

經(jīng)過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化和篩選培養(yǎng)，獲得了具有潮霉素抗性的愈傷組織。在分化和生根培養(yǎng)后，成功獲得了再生植株。分子鑒定結(jié)果表明，部分再生植株中檢測到目的基因的整合和表達(dá)，證明成功建立了南荻的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。通過優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件，如農(nóng)桿菌菌液濃度、共培養(yǎng)時間等，可將轉(zhuǎn)化效率提高到一定水平，為后續(xù)的基因工程應(yīng)用提供了足夠數(shù)量的轉(zhuǎn)化植株。

四、討論

（一）組織培養(yǎng)條件的優(yōu)化

在南荻愈傷組織誘導(dǎo)過程中，外植體的類型和生理狀態(tài)對誘導(dǎo)率有著重要影響。幼嫩的外植體通常具有更高的誘導(dǎo)潛力，這可能是由于其細(xì)胞的分化程度較低，具有更強的再生能力。培養(yǎng)基中的激素種類和濃度是另一個關(guān)鍵因素，不同激素組合對于愈傷組織的誘導(dǎo)、增殖和分化有著不同的調(diào)控作用。在本研究中，通過多次試驗確定的激素濃度和比例有效地促進了南荻愈傷組織的形成和生長。

（二）遺傳轉(zhuǎn)化效率的提高

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化過程中，多個環(huán)節(jié)影響轉(zhuǎn)化效率。農(nóng)桿菌菌株的選擇、載體的構(gòu)建以及共培養(yǎng)條件等都需要精細(xì)優(yōu)化。乙酰丁香酮的添加在共培養(yǎng)過程中能夠顯著提高轉(zhuǎn)化效率，可能是通過激活農(nóng)桿菌的 Vir 基因表達(dá)，促進 T - DNA 向植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。篩選劑的濃度和篩選時間也需要謹(jǐn)慎確定，過高的濃度可能導(dǎo)致假陽性或抑制愈傷組織的生長，而過低則無法有效篩選出真正的轉(zhuǎn)化體。

（三）在基因工程中的應(yīng)用前景

建立的南荻遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)為南荻的基因工程應(yīng)用開辟了廣闊的道路。通過導(dǎo)入抗逆基因，可以提高南荻對干旱、鹽堿等惡劣環(huán)境的適應(yīng)能力，擴大其種植范圍。導(dǎo)入與纖維素合成或降解相關(guān)的基因，有望進一步提高南荻的生物質(zhì)品質(zhì)，優(yōu)化其在生物質(zhì)能源和造紙工業(yè)中的應(yīng)用。此外，利用基因編輯技術(shù)結(jié)合本遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，可以對南荻的內(nèi)源基因進行精準(zhǔn)編輯，創(chuàng)造具有特殊性狀的新種質(zhì)資源。

五、結(jié)論

本研究成功建立了南荻遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，包括外植體消毒、愈傷組織誘導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化以及再生植株的獲得和鑒定等環(huán)節(jié)。通過對各環(huán)節(jié)的優(yōu)化，提高了轉(zhuǎn)化效率和再生植株的質(zhì)量。該遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)在南荻基因工程應(yīng)用方面具有重要價值，為南荻的品種改良和生物質(zhì)資源開發(fā)提供了有力的技術(shù)支撐，將有力推動南荻相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和對可再生能源的利用。未來的研究可以進一步完善該系統(tǒng)，拓展其在更多基因功能研究和應(yīng)用領(lǐng)域的潛力。