氫乙啶作為測量活性氧物種的探針有效地工作。染料自由進(jìn)入細(xì)胞并脫氫為乙錠化合物。該探針已被廣泛用于NK細(xì)胞，并作為鑒定腫瘤中增殖和缺氧細(xì)胞的重要染料。已經(jīng)使用中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞以及HL60細(xì)胞和巨噬細(xì)胞進(jìn)行了研究。這種探針的一個主要優(yōu)點(diǎn)是它能夠區(qū)分超氧化物和過氧化氫。熒光發(fā)射發(fā)生在600nm左右。

氫乙錠[二氫乙錠]的化學(xué)結(jié)構(gòu)

艾美捷AAT Bioquest-Hydroethidine二氫乙錠：

貨號 15200

單位尺寸 25 毫克

分子量 315.41

溶劑 DMSO

激發(fā)（納米） 500

發(fā)射（納米） 582

預(yù)期用途 僅用于研究（RUO）

風(fēng)險短語 R20, R21, R22

儲存 冷凍（< -15°C）；盡量減少光照暴露

熒光微孔板讀取器

激發(fā) 520 納米

發(fā)射 600 納米

截止 550 納米

推薦板 實(shí)心黑色

庫存溶液的準(zhǔn)備：

除非另有說明，所有未使用的庫存溶液應(yīng)在制備后分成單次使用的小份，并儲存在-20°C。避免反復(fù)凍融。

配制5-10 mM的DMSO庫存溶液。注意：未使用的DMSO庫存溶液應(yīng)分裝到單次使用的小瓶中，并儲存在-20°C。避光保存。

工作溶液的準(zhǔn)備：

在生理緩沖液（如PBS、HBSS、HEPES）中配制5-20 µM的染料工作濃度。注意：您的應(yīng)用的最佳工作濃度必須通過實(shí)驗(yàn)確定。

樣品實(shí)驗(yàn)方案：

將等體積（例如100 µL的細(xì)胞在生長介質(zhì)中）的染料工作溶液加入到細(xì)胞中，然后在室溫或37°C下孵化細(xì)胞5至60分鐘。

在將細(xì)胞暴露于實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)因素之前，確定加載細(xì)胞的樣本的基線熒光強(qiáng)度。

陰性對照應(yīng)按以下方式評估：

檢查染料和緩沖液/介質(zhì)的無細(xì)胞混合物的熒光，無論是否含有誘導(dǎo)劑。在沒有細(xì)胞外酯酶和其他氧化酶的情況下，隨時間熒光的逐漸增加可能與自發(fā)水解、大氣氧化和/或光誘導(dǎo)氧化有關(guān)。

檢查未經(jīng)處理（對照）的加載細(xì)胞的熒光，這些細(xì)胞一直在生長介質(zhì)或緩沖液中維持。在健康細(xì)胞中，氧自由基被細(xì)胞酶和/或天然抗氧化劑清除。在染料加載恢復(fù)期之后，健康細(xì)胞應(yīng)表現(xiàn)出在實(shí)驗(yàn)期間相對穩(wěn)定的低水平熒光；然而，可能觀察到熒光的逐漸增加（由于自氧化）或減少（由于細(xì)胞中染料的丟失或光漂白）。在沒有任何刺激或誘導(dǎo)的情況下，健康、未經(jīng)處理的細(xì)胞中熒光的突發(fā)可能表明細(xì)胞死亡的進(jìn)展或其他氧化事件。

陽性對照可以用叔丁基過氧化氫（TBHP）刺激至約100 µM的最終濃度（根據(jù)細(xì)胞的敏感性和反應(yīng)增減劑量）。

文獻(xiàn)參考：

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The confounding effects of light, sonication, and Mn(III)TBAP on quantitation of superoxide using hydroethidine

Authors: Zielonka J, Vasquez-Vivar J, Kalyanaraman B.

Journal: Free Radic Biol Med (2006): 1050

Pulse radiolysis and steady-state analyses of the reaction between hydroethidine and superoxide and other oxidants

Authors: Zielonka J, Sarna T, Roberts JE, Wishart JF, Kalyanaraman B.

Journal: Arch Biochem Biophys. (2006)

Generation of superoxide anion by equine spermatozoa as detected by dihydroethidium

Authors: Burnaugh L, Sabeur K, Ball BA.

Journal: Theriogenology. (2006)

Analysis of dihydroethidium-derived oxidation products by HPLC in the assessment of superoxide production and NADPH oxidase activity in vascular systems

Authors: Fern, undefined and es DC, Wosniak J, Pescatore LA, Bertoline MA, Liberman M, Laurindo F, Santos CX.

Journal: Am J Physiol Cell Physiol. (2006)

Mechanistic similarities between oxidation of hydroethidine by Fremy's salt and superoxide: stopped-flow optical and EPR studies

Authors: Zielonka J, Zhao H, Xu Y, Kalyanaraman B.

Journal: Free Radic Biol Med (2005): 853

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