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宿主gDNA、試劑背景核酸污染去除只需一款Thermolabile dsDNase!

來(lái)源:翌圣生物科技(上海)股份有限公司   2024年12月17日 08:53  

蛋白純度≥99%,65℃加熱10 min即可快速失活,對(duì)樣品中RNA無(wú)影響。

在診斷或研究由病原感染引起的疾病時(shí),當(dāng)前的檢測(cè)方法大多針對(duì)病原體的基因組進(jìn)行診斷。然而,僅依靠檢測(cè)病原體的基因組核酸只能確認(rèn)病毒的存在,不足以反映持續(xù)感染或整合入宿主基因組的風(fēng)險(xiǎn)。例如,人乳頭瘤病毒(HPV)DNA的檢出可能只是一次性感染,不代表持續(xù)病變或癌變風(fēng)險(xiǎn)。相反,檢測(cè)HPV E6/E7 mRNA水平能提供更精確信息,評(píng)估HPV在宿主體內(nèi)的基因組整合、轉(zhuǎn)錄活性及持續(xù)感染和致癌可能性。這種方法更關(guān)注“病變”而非僅僅是“感染”,有助于識(shí)別可能進(jìn)展為浸潤(rùn)癌的癌前病變,避免對(duì)一次性HPV感染及其良性病變的過度探查和不必要治療。

圖1:HPV病毒感染宮頸細(xì)胞示意圖

為確?;騧RNA表達(dá)量分析的準(zhǔn)確性,必須排除樣本中基因組DNA(gDNA)的干擾,因?yàn)槠浯嬖诳赡軐?dǎo)致mRNA定量結(jié)果的誤差,有效去除mRNA樣本中的gDNA一直是一個(gè)技術(shù)難題。目前,DNase I是主流用于去除gDNA的酶,但DNase I的滅活需要在體系中額外加入EDTA,容易導(dǎo)致后續(xù)擴(kuò)增反應(yīng)受抑制。

 

翌圣Thermolabile dsDNase

針對(duì)以上問題,翌圣生物推出了一種熱敏雙鏈DNA特異性核酸酶——Thermolabile dsDNase。該酶能夠選擇性地降解雙鏈DNA,而對(duì)單鏈核酸分子幾乎沒有影響。通過裂解雙鏈DNA中的磷酸二酯鍵,生成帶有5'-磷酸和3'-羥基末端的寡核苷酸片段。更重要的是,該產(chǎn)品具有熱敏感性,在65°C條件下可以迅速失活。相比傳統(tǒng)的DNase I,Thermolabile dsDNase更適合快速去除基因組DNA,并且與RT-PCR反應(yīng)緩沖液兼容,因此可以直接應(yīng)用于RT-PCR/qPCR等過程中,以清除gDNA污染,從而提高反轉(zhuǎn)錄效率。

圖2. Thermolabile dsDNase去除gDNA示意圖

 

產(chǎn)品特點(diǎn)

  • 高效:只需37℃ 5 min即可消化1 μg基因組DNA;

  • 純度高:蛋白純度≥99%;

  • 無(wú)RNase酶殘留:對(duì)樣品中RNA無(wú)影響;

  • 熱敏感:65℃加熱10 min即可快速失活,無(wú)需純化,gDNA去除與逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可在同管內(nèi)完成;

  • 應(yīng)用廣泛RNA提取或反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)前去除gDNA、分子診斷試劑原料中背景菌gDNA污染去除。

 

性能展示

  1. 純度高:蛋白純度≥99%

圖3:SDS-PAGE法檢測(cè)14544ES蛋白純度結(jié)果

  1. 無(wú)RNase酶殘留:對(duì)樣品中RNA無(wú)影響

圖4:20 μL反應(yīng)體系中加入20 U來(lái)自進(jìn)口廠家A、進(jìn)口廠家B和翌圣3批次Thermolabile dsDNase,同時(shí)分別加入0.5 μg 293T RNA,37℃孵育4小時(shí)。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示,翌圣3批次Thermolabile dsDNase組RNA譜帶與陰性對(duì)照一致,進(jìn)口廠家A和進(jìn)口廠家B組RNA條帶有輕微降解,說明翌圣3批次Thermolabile dsDNase中無(wú)RNase殘留,對(duì)樣本中RNA無(wú)影響。

 

  1. 熱敏感65℃加熱10 min即可快速失活

圖5:Thermolabile dsDNase熱敏感性驗(yàn)證結(jié)果圖。陰性對(duì)照組:未加dsDNase酶;陽(yáng)性對(duì)照組:反應(yīng)體系中加入0.2 U來(lái)自進(jìn)口廠家A、進(jìn)口廠家B和翌圣3批次Thermolabile dsDNase;熱處理組:反應(yīng)體系中加入20 U來(lái)自進(jìn)口廠家A、進(jìn)口廠家B和翌圣3批次經(jīng)過65℃加熱10 min處理的Thermolabile dsDNase酶。然后,分別在體系中加入1 μg小牛胸腺DNA,37℃孵育5 min。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示,0.2 U Thermolabile dsDNase可消化1 μg小牛胸腺DNA,Thermolabile dsDNase經(jīng)過65℃孵育10 min可完失活。

 

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產(chǎn)品定位

產(chǎn)品名稱

產(chǎn)品貨號(hào)

gDNA去除

Thermolabile dsDNase

14544ES

Recombinant DNase I (RNase-free)

10325ES

UCF.ME® Deoxyribonuclease I (DNase I) GMP-grade

10611ES

高性能PCR單酶系列

Hieff UNICON® Hotstart E-Taq DNA Polymerase, 5 U/μL

10726ES

Hifair® V Reverse Transcriptase (200 U/μL)

11300ES

Uracil DNA Glycosylase(UDG/UNG),heat-labile1 U/μL

10303ES

Murine RNase Inhibitor (40 U/µL)

10603ES

dNTP Mix (25 mM each)

10125ES

 

參考文獻(xiàn)

  1. Ndiaye C, Mena M, Alemany L, et al. HPV DNA, E6/E7 mRNA, and p16INK4a detection in head and neck cancers: a systematic review and meta-analysis[J]. The Lancet Oncology, 2014, 15(12): 1319-1331.

  2. Broccolo F, Fusetti L, Rosini S, et al. Comparison of oncogenic HPV type‐specific viral DNA load and E6/E7 mRNA detection in cervical samples: results from a multicenter study[J]. Journal of medical virology, 2013, 85(3): 472-482.

 


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