摘要
本研究聚焦于優(yōu)化外源基因?qū)氩溉閯?dòng)物細(xì)胞的條件。詳細(xì)闡述多種轉(zhuǎn)染方法，對(duì)比分析不同轉(zhuǎn)染試劑、細(xì)胞密度、DNA 濃度及孵育時(shí)間等因素對(duì)外源基因?qū)胄实挠绊?，通過(guò)嚴(yán)謹(jǐn)實(shí)驗(yàn)得出最佳組合，為基因工程、生物醫(yī)藥研發(fā)等領(lǐng)域提供關(guān)鍵技術(shù)支撐，推動(dòng)相關(guān)研究進(jìn)展。
一、引言
隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的飛速發(fā)展，外源基因?qū)氩溉閯?dòng)物細(xì)胞已成為基因功能研究、基因治療以及生物制藥等眾多領(lǐng)域的核心技術(shù)環(huán)節(jié)。成功且高效地將外源基因?qū)爰?xì)胞，意味著能夠精準(zhǔn)操控細(xì)胞的遺傳信息，賦予細(xì)胞新的功能特性，為攻克各類疑難病癥、開發(fā)新型生物制品開辟道路。然而，當(dāng)前外源基因?qū)脒^(guò)程面臨諸多挑戰(zhàn)，如轉(zhuǎn)染效率低下、細(xì)胞毒性大、導(dǎo)入后基因表達(dá)不穩(wěn)定等問題，嚴(yán)重制約相關(guān)研究與應(yīng)用的深入拓展。因此，系統(tǒng)地優(yōu)化外源基因?qū)氩溉閯?dòng)物細(xì)胞的條件迫在眉睫，本研究旨在通過(guò)一系列精細(xì)實(shí)驗(yàn)，探尋切實(shí)可行的優(yōu)化策略。
二、實(shí)驗(yàn)材料與方法
（一）細(xì)胞系與培養(yǎng)條件
選用常見的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，如 HEK293 細(xì)胞、HeLa 細(xì)胞及 CHO 細(xì)胞等。細(xì)胞培養(yǎng)于含 10% 胎牛血清、1% 雙抗（青霉素 - 鏈霉素）的 DMEM 高糖培養(yǎng)基中，置于 37°C、5% CO?的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，確保細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期用于實(shí)驗(yàn)，以保證細(xì)胞狀態(tài)的一致性與穩(wěn)定性，減少因細(xì)胞自身差異對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。
（二）外源基因與載體構(gòu)建
選取具有明確功能標(biāo)記的外源基因，如綠色熒光蛋白基因（GFP），通過(guò)分子克隆技術(shù)將其精準(zhǔn)插入到合適的表達(dá)載體上，如 pcDNA3.1 質(zhì)粒。對(duì)構(gòu)建好的重組質(zhì)粒進(jìn)行大量提取與純化，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、測(cè)序驗(yàn)證等手段確?；蛐蛄袦?zhǔn)確無(wú)誤、質(zhì)粒純度達(dá)標(biāo)，為后續(xù)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)提供高質(zhì)量的基因材料。
（三）轉(zhuǎn)染方法與分組設(shè)計(jì)
脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法：采用不同商業(yè)品牌的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，按照各自說(shuō)明書，將重組質(zhì)粒與脂質(zhì)體按一定比例混合，室溫孵育形成復(fù)合物后加入細(xì)胞培養(yǎng)皿。設(shè)置多組不同脂質(zhì)體用量（如 1 μL - 10 μL）、質(zhì)粒 DNA 濃度（如 0.1 μg/μL - 1 μg/μL）的實(shí)驗(yàn)組，以探究最佳配比組合。
電穿孔轉(zhuǎn)染法：利用電轉(zhuǎn)儀，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞重懸于電轉(zhuǎn)緩沖液，加入適量重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)移至電轉(zhuǎn)杯，設(shè)置不同的電壓參數(shù)（如 100 V - 300 V）、脈沖時(shí)間（如 10 ms - 50 ms）進(jìn)行電擊操作，隨后迅速將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，分析不同電穿孔條件對(duì)基因?qū)氲挠绊憽?/p>
病毒載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法：構(gòu)建攜帶外源基因的慢病毒或腺病毒載體，感染靶細(xì)胞。通過(guò)控制病毒感染復(fù)數(shù)（MOI，如 0.1 - 10）、感染時(shí)間（如 2 h - 24 h），研究病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的優(yōu)化條件，同時(shí)設(shè)置未感染病毒的對(duì)照組，監(jiān)測(cè)細(xì)胞狀態(tài)與基因表達(dá)情況。
（四）轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)
在轉(zhuǎn)染后特定時(shí)間點(diǎn)（如 24 h - 72 h），利用熒光顯微鏡觀察 GFP 陽(yáng)性細(xì)胞比例，直觀判斷轉(zhuǎn)染效率；同時(shí)結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)，精確量化表達(dá) GFP 的細(xì)胞數(shù)量占總細(xì)胞數(shù)的百分比，對(duì)不同實(shí)驗(yàn)組的轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行嚴(yán)謹(jǐn)統(tǒng)計(jì)分析，確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性與可靠性。
三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
（一）脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法結(jié)果
不同脂質(zhì)體試劑及用量、DNA 濃度組合呈現(xiàn)出顯著差異的轉(zhuǎn)染效率。部分脂質(zhì)體在低用量時(shí)轉(zhuǎn)染效率極低，隨著用量增加，轉(zhuǎn)染效率逐步上升，但當(dāng)超過(guò)一定閾值（如 6 μL）后，細(xì)胞毒性加劇，出現(xiàn)大量死亡細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率反而下降。在適宜的脂質(zhì)體用量（如 4 μL）與 DNA 濃度（如 0.5 μg/μL）搭配下，部分實(shí)驗(yàn)組可實(shí)現(xiàn)高達(dá) 40% - 50% 的轉(zhuǎn)染效率，且細(xì)胞形態(tài)保持相對(duì)完整，生長(zhǎng)狀態(tài)良好。
（二）電穿孔轉(zhuǎn)染法結(jié)果
電壓與脈沖時(shí)間是電穿孔轉(zhuǎn)染的關(guān)鍵影響因素。較低電壓（如 100 V - 150 V）結(jié)合短脈沖時(shí)間（如 10 ms - 20 ms）時(shí)，細(xì)胞損傷較小，但外源基因?qū)胄什蛔?20%；逐步升高電壓、延長(zhǎng)脈沖時(shí)間，轉(zhuǎn)染效率顯著提升，在 250 V、30 ms 條件下，部分細(xì)胞系轉(zhuǎn)染效率可達(dá) 30% - 40%，然而細(xì)胞死亡率也隨之急劇上升，超過(guò)半數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)不可逆損傷，難以維持正常代謝與增殖。
（三）病毒載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法結(jié)果
隨著病毒感染復(fù)數(shù)（MOI）增加，外源基因?qū)爰?xì)胞的比例相應(yīng)提高。MOI 為 1 時(shí)，僅有少量細(xì)胞表達(dá)外源基因，轉(zhuǎn)染效率低于 10%；當(dāng) MOI 提升至 5 - 10 時(shí)，多數(shù)細(xì)胞被成功感染，轉(zhuǎn)染效率可達(dá) 60% - 80%，但高 MOI 下長(zhǎng)時(shí)間感染（如 24 h）易引發(fā)細(xì)胞免疫應(yīng)激反應(yīng)，細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、脫落等現(xiàn)象，影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作與基因穩(wěn)定表達(dá)。
四、討論
（一）不同轉(zhuǎn)染方法的優(yōu)劣剖析
脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法操作簡(jiǎn)便、成本相對(duì)較低，無(wú)需特殊設(shè)備，適用于常規(guī)實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。但其轉(zhuǎn)染效率受脂質(zhì)體質(zhì)量、細(xì)胞類型影響較大，且存在一定細(xì)胞毒性風(fēng)險(xiǎn)。電穿孔轉(zhuǎn)染法能夠?qū)崿F(xiàn)較高的基因?qū)胄?，尤其?duì)一些難轉(zhuǎn)染細(xì)胞有更好優(yōu)勢(shì)，但對(duì)細(xì)胞損傷嚴(yán)重，參數(shù)優(yōu)化復(fù)雜，需要精確控制電壓、脈沖等條件，否則易導(dǎo)致細(xì)胞大量死亡，后續(xù)實(shí)驗(yàn)難以開展。病毒載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法具有較好的轉(zhuǎn)染效率，可實(shí)現(xiàn)基因長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)，在基因治療領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。然而，病毒載體構(gòu)建與包裝過(guò)程繁瑣，生物安全性問題不容忽視，如潛在的免疫原性、病毒基因組整合引發(fā)的基因突變風(fēng)險(xiǎn)等。
（二）關(guān)鍵因素對(duì)轉(zhuǎn)染效果的影響機(jī)制
轉(zhuǎn)染試劑用量與 DNA 濃度：脂質(zhì)體等轉(zhuǎn)染試劑通過(guò)包裹 DNA 形成復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞，用量不足難以有效攜帶足量 DNA 入胞，而過(guò)量則會(huì)破壞細(xì)胞膜穩(wěn)定性，引發(fā)細(xì)胞毒性，影響轉(zhuǎn)染效率與細(xì)胞存活。適宜的 DNA 濃度既要保證有足夠的基因拷貝數(shù)供細(xì)胞攝取表達(dá)，又不能超出細(xì)胞負(fù)荷，避免代謝紊亂。
電穿孔參數(shù)：電壓與脈沖時(shí)間直接決定細(xì)胞膜穿孔的程度與范圍。電壓過(guò)低、脈沖過(guò)短，細(xì)胞膜穿孔不充分，外源基因難以進(jìn)入；反之，過(guò)度穿孔致使細(xì)胞膜修復(fù)困難，細(xì)胞內(nèi)環(huán)境失衡，導(dǎo)致死亡。細(xì)胞在電穿孔瞬間經(jīng)歷劇烈的電場(chǎng)變化，其自身應(yīng)激修復(fù)機(jī)制與基因?qū)胄蚀嬖趶?fù)雜的動(dòng)態(tài)平衡關(guān)系，需精細(xì)調(diào)控。
病毒感染復(fù)數(shù)與時(shí)間：MOI 反映了病毒顆粒與細(xì)胞數(shù)量的比例關(guān)系，MOI 越高，理論上病毒感染細(xì)胞的機(jī)會(huì)越大，但過(guò)高易觸發(fā)細(xì)胞抗病毒免疫反應(yīng)，干擾外源基因整合與表達(dá)，同時(shí)長(zhǎng)時(shí)間感染加重細(xì)胞負(fù)擔(dān)，破壞細(xì)胞正常生理功能。
（三）綜合優(yōu)化策略探討
綜合考慮實(shí)驗(yàn)結(jié)果與各因素影響機(jī)制，對(duì)于常規(guī)基因功能初步探索實(shí)驗(yàn)，在細(xì)胞耐受性良好的前提下，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法可優(yōu)先選擇中等效能脂質(zhì)體，搭配優(yōu)化后的試劑用量（如 3 μL - 5 μL）與 DNA 濃度（如 0.3 μg/μL - 0.6 μg/μL），能在較低成本下實(shí)現(xiàn) 30% - 40% 的轉(zhuǎn)染效率，滿足基本需求。若針對(duì)難轉(zhuǎn)染細(xì)胞系或?qū)驅(qū)胄室髧?yán)格的研究，如基因治療載體開發(fā)，可謹(jǐn)慎采用電穿孔轉(zhuǎn)染法，結(jié)合細(xì)胞類型預(yù)實(shí)驗(yàn)，精細(xì)優(yōu)化電壓（如 200 V - 250 V）、脈沖時(shí)間（如 20 ms - 30 ms），并在轉(zhuǎn)染后及時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基，添加細(xì)胞保護(hù)劑，減輕細(xì)胞損傷，保障一定轉(zhuǎn)染成功率。而在涉及長(zhǎng)期基因表達(dá)調(diào)控、體內(nèi)基因治療應(yīng)用時(shí)，病毒載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法需深入權(quán)衡病毒載體安全性與有效性，選取低免疫原性病毒骨架，精準(zhǔn)控制 MOI（如 3 - 6）與感染時(shí)間（如 6 h - 12 h），結(jié)合免疫抑制劑使用，降低細(xì)胞免疫應(yīng)激，實(shí)現(xiàn)外源基因穩(wěn)定、高效導(dǎo)入與表達(dá)。
五、結(jié)論
本研究通過(guò)系統(tǒng)對(duì)比脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電穿孔轉(zhuǎn)染及病毒載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染等多種方法，深入探究轉(zhuǎn)染試劑、電穿孔參數(shù)、病毒感染條件等關(guān)鍵因素對(duì)外源基因?qū)氩溉閯?dòng)物細(xì)胞效率的影響，明確不同方法的適用場(chǎng)景與優(yōu)化路徑。這為科研人員在基因工程、細(xì)胞生物學(xué)、生物醫(yī)藥研發(fā)等領(lǐng)域開展外源基因?qū)牍ぷ魈峁┝巳?、精?zhǔn)的技術(shù)參考，有望突破當(dāng)前相關(guān)研究中基因轉(zhuǎn)染瓶頸，加速科研成果轉(zhuǎn)化，推動(dòng)生命科學(xué)領(lǐng)域蓬勃發(fā)展。未來(lái)研究可聚焦于開發(fā)新型、低毒高效轉(zhuǎn)染試劑，進(jìn)一步優(yōu)化轉(zhuǎn)染流程，拓展外源基因?qū)爰夹g(shù)在復(fù)雜生物體系中的應(yīng)用深度與廣度。
手機(jī)版
化工儀器網(wǎng)手機(jī)版
化工儀器網(wǎng)小程序
官方微信
公眾號(hào)：chem17
掃碼關(guān)注視頻號(hào)
采購(gòu)中心