国产精品视频一区二区三区四,亚洲av美洲av综合av,99国内精品久久久久久久,欧美电影一区二区三区电影

產(chǎn)品推薦:氣相|液相|光譜|質(zhì)譜|電化學(xué)|元素分析|水分測(cè)定儀|樣品前處理|試驗(yàn)機(jī)|培養(yǎng)箱


化工儀器網(wǎng)>技術(shù)中心>解決方案>正文

歡迎聯(lián)系我

有什么可以幫您? 在線咨詢

案例分享 | 質(zhì)粒提取的常見(jiàn)問(wèn)題和解決方案!

來(lái)源:翌圣生物科技(上海)股份有限公司   2024年12月27日 13:34  

 


 

柱式法質(zhì)粒提取的原理

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

柱式法質(zhì)粒提取主要基于SDS-堿裂解法。細(xì)胞在高pH的強(qiáng)陰離子洗滌劑SDS作用下,細(xì)胞壁被裂解,染色體DNA和蛋白質(zhì)發(fā)生變性并相互纏繞形成大型復(fù)合物。這些復(fù)合物在鉀離子取代鈉離子時(shí)從溶液中沉淀下來(lái),而質(zhì)粒DNA則留在上清液中。由于DNA帶負(fù)電,質(zhì)粒提取柱中的硅基質(zhì)膜在高鹽條件下能選擇性地吸附DNA。通過(guò)去離子水洗脫,最終得到純化的質(zhì)粒DNA。

 

 

質(zhì)粒提取的每種試劑關(guān)鍵成分是什么呢?今天我們來(lái)大揭秘

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

組分

關(guān)鍵成分和功能

緩沖液 RS*(P1)

關(guān)鍵成分:25mM Tris-HCl(pH8.0)、10mM EDTA、50mM 葡萄糖

功能:將菌體沉淀懸浮起來(lái),有助于后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。

:在使用緩沖液 RS*之前,需要添加 RNase A,該酶的作用是降解溶液中的 RNA

裂解液 LB(P2)

關(guān)鍵成分:250mM NaOH、1%(W/V)SDS(十二烷基硫酸鈉)

功能:細(xì)胞進(jìn)行裂解

結(jié)合液 BD(P3)

關(guān)鍵成分:3M醋酸鉀(potassium acetate)和5M醋酸

功能:中和NaOH,并清除蛋白質(zhì)等細(xì)胞內(nèi)雜質(zhì)

漂洗液 W*

關(guān)鍵成分:10mM Tris-HCl(pH7.5)、80%乙醇(Ethanol)

功能:去除DNA提取過(guò)程中產(chǎn)生的多余鹽離子

洗脫液

關(guān)鍵成分:10mM Tris-HCl(pH7.5)的溶液

功能:幫助DNA從硅膠柱中洗脫出來(lái)

 

 

 

質(zhì)粒提取之后,如何評(píng)估質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量和質(zhì)量呢?

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

目前使用分光光度法定量質(zhì)粒DNA通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)粒DNA產(chǎn)率和質(zhì)量的分析是兩種常用的方法。

 

舉例:提取2 mL過(guò)夜培養(yǎng)的大腸桿菌PUC19質(zhì)粒,分光光度法檢測(cè)質(zhì)粒的得率,在15 μg左右,260/280=1.8~2.0,260/230=2.0~2.3;瓊脂糖凝膠電泳顯示三條帶,從上至下依次為:開(kāi)環(huán)DNA、線性DNA、超螺旋DNA,其中超螺旋DNA的占比>90%。

 

 

 

 

質(zhì)粒提取常見(jiàn)問(wèn)題案例梳理

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
01

出現(xiàn)嚴(yán)重的RNA污染

如圖所示,質(zhì)粒提取之后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,出現(xiàn)明顯的RNA條帶,說(shuō)明有RNA污染。

 

原因及解決方法:

(1)未在緩沖液 RS*中事先加入RNase A。解決方法:補(bǔ)加RNase A。

(2)加入RNase A的緩沖液 RS*長(zhǎng)期保存于室溫,導(dǎo)致RNase A活性下降。解決方法:每次使用后置于 4℃保存。若長(zhǎng)期不用,置于-20℃保存。

(3)細(xì)菌過(guò)量,RNase A不能有效降解RNA。解決方法:將細(xì)菌用量減半或增加RNase A在緩沖液 RS*中的濃度。

 

02

出現(xiàn)基因組污染

(1)菌體裂解和中和過(guò)程中,劇烈混合造成基因組DNA斷裂所致。解決方法:溫和地進(jìn)行菌體的裂解和中和。

(2)加裂解液 LB時(shí)操作時(shí)間過(guò)長(zhǎng),造成基因組DNA斷裂所致。解決方法:將裂解步驟控制在5分鐘內(nèi)完成。

(3)細(xì)菌的質(zhì)量差(反復(fù)凍融的細(xì)菌,陳舊的細(xì)菌,培養(yǎng)條件不合適的細(xì)菌等)中有許多斷裂或降解而游離的基因組DNA,使用生長(zhǎng)良好的新鮮細(xì)菌。

 

03

超螺旋質(zhì)粒比例低

如圖右所示,質(zhì)粒提取之后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,開(kāi)環(huán)質(zhì)粒的占比約20%,說(shuō)明超螺旋比例低,一般超螺旋比例需要>90%,一般來(lái)說(shuō)超螺旋比例越高,質(zhì)粒的穩(wěn)定性越高,高超螺旋比例的質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染效率、基因表達(dá)水平等方面具有更好的表現(xiàn)。

 

 

原因:裂解時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng),加入裂解液后裂解時(shí)間不應(yīng)超過(guò)5分鐘,以免質(zhì)粒受到破壞

解決方法:優(yōu)化裂解時(shí)間;確保質(zhì)粒的結(jié)合和所有溶液都在室溫下進(jìn)行,減少離心力對(duì)質(zhì)粒超螺旋結(jié)構(gòu)的影響,因?yàn)檫^(guò)度的離心可能會(huì)破壞質(zhì)粒的超螺旋結(jié)構(gòu)。

 

04

內(nèi)毒素殘留高

 

常規(guī)質(zhì)粒DNA純化中,質(zhì)粒DNA仍需要從55%蛋白質(zhì)、20%RNA、3%內(nèi)毒素和3%基因組DNA中分離,在質(zhì)粒DNA制備的菌體裂解過(guò)程中,內(nèi)毒素分子被釋放到溶菌液中。由于內(nèi)毒素常形成囊狀結(jié)構(gòu),其分子量、電荷性和疏水性都與質(zhì)粒DNA相似,常用的純化方法很難將內(nèi)毒素與質(zhì)粒DNA分開(kāi)。內(nèi)毒素會(huì)降低原代細(xì)胞和敏感培養(yǎng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率,干擾免疫細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)染。由于實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌瑢?duì)質(zhì)粒DNA的內(nèi)毒素要求亦不同,尤其是在細(xì)胞轉(zhuǎn)染、基因沉默研究、基因治療等過(guò)程中,對(duì)質(zhì)粒質(zhì)量、內(nèi)毒素水平要求更為苛刻,對(duì)于非敏感型的的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),要求內(nèi)毒素殘留0.1~2.5 EU/ug,對(duì)于敏感型的的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),要求內(nèi)毒素殘留<0.1 EU/ug。

 

原因:內(nèi)毒素去除時(shí)操作不當(dāng)或者未選擇合適的試劑

解決方法:

(1)如果采用的內(nèi)毒素清除的方法,離心之后,上層水相含DNA,下層藍(lán)色油狀相含內(nèi)毒素和其它雜質(zhì)。這時(shí)注意不要吸到藍(lán)色油狀層,里面含內(nèi)毒素等雜質(zhì)。

(2)在使用樹脂純化系統(tǒng)去除內(nèi)毒素時(shí),需要先活化樹脂,然后使用平衡緩沖液平衡樹脂,以確保最佳的去除效率。

 

翌圣生物的質(zhì)粒提取試劑盒,歷經(jīng)市場(chǎng)多年的磨礪與錘煉,產(chǎn)品成熟而穩(wěn)定。產(chǎn)品品質(zhì),不僅贏得了廣泛的認(rèn)可與贊譽(yù),更累積了超過(guò)300的影響因子總分?jǐn)?shù),成為眾多科研工作者!

 

 

 

產(chǎn)品推薦

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

柱式法

貨號(hào)

產(chǎn)品名稱

規(guī)格

19021ES50/ES70

MolPure® Endo-free Plasmid Mini Kit 無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒小量提取試劑盒

50T/200T

19001ES50/ES70

MolPure® Plasmid Mini Kit 質(zhì)粒小量提取試劑盒

50T/200T

19036ES10

MolPure® Endo-free Plasmid Maxi Kit 無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取試劑盒

10T

19101ES50/ES70

MolPure® Gel Extraction Kit 瓊脂糖凝膠回收試劑盒

50T/200T

19106ES50/ES70

MolPure® PCR Purification Kit   PCR產(chǎn)物純化試劑盒

50T/200T

 

磁珠法

貨號(hào)

產(chǎn)品名稱

規(guī)格

備注

18538ES50/ES70

MolPure® Magnetic Plasmid Mini Kit 磁珠法質(zhì)粒小量提取

50 T/200 T

磁珠,瓶裝

18539ES16/48

MolPure® Mag16/48 Plasmid Mini Kit(Prepackaged)
磁珠法16/48孔質(zhì)粒小量提取試劑盒(預(yù)封裝)

16 T/48T

磁珠16/48預(yù)裝,適配AP-16S和AP-48

18541ES96

MolPure® Mag96 Plasmid Mini Kit (Prepackaged)磁珠法96孔質(zhì)粒小量提取試劑盒(預(yù)封裝)

96T

磁珠96預(yù)裝,適配AP-96N

18542ES48

18542ES MolPure® Magnetic Endo-free Plasmid Mini Kit 磁珠法去內(nèi)毒素質(zhì)粒小量提取試劑盒

48 T

磁珠,瓶裝

18543ES24/ES48

18543ES MolPure® Magnetic Plasmid med Kit 磁珠法質(zhì)粒去內(nèi)毒素中量提取試劑盒

24T/48 T

磁珠,瓶裝



免責(zé)聲明

  • 凡本網(wǎng)注明“來(lái)源:化工儀器網(wǎng)”的所有作品,均為浙江興旺寶明通網(wǎng)絡(luò)有限公司-化工儀器網(wǎng)合法擁有版權(quán)或有權(quán)使用的作品,未經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)不得轉(zhuǎn)載、摘編或利用其它方式使用上述作品。已經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)使用作品的,應(yīng)在授權(quán)范圍內(nèi)使用,并注明“來(lái)源:化工儀器網(wǎng)”。違反上述聲明者,本網(wǎng)將追究其相關(guān)法律責(zé)任。
  • 本網(wǎng)轉(zhuǎn)載并注明自其他來(lái)源(非化工儀器網(wǎng))的作品,目的在于傳遞更多信息,并不代表本網(wǎng)贊同其觀點(diǎn)和對(duì)其真實(shí)性負(fù)責(zé),不承擔(dān)此類作品侵權(quán)行為的直接責(zé)任及連帶責(zé)任。其他媒體、網(wǎng)站或個(gè)人從本網(wǎng)轉(zhuǎn)載時(shí),必須保留本網(wǎng)注明的作品第一來(lái)源,并自負(fù)版權(quán)等法律責(zé)任。
  • 如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問(wèn)題,請(qǐng)?jiān)谧髌钒l(fā)表之日起一周內(nèi)與本網(wǎng)聯(lián)系,否則視為放棄相關(guān)權(quán)利。
企業(yè)未開(kāi)通此功能
詳詢客服 : 0571-87858618
临湘市| 定日县| 怀集县| 息烽县| 宁德市| 黄石市| 象州县| 文安县| 正宁县| 姜堰市| 健康| 洛川县| 沙洋县| 新乐市| 清丰县| 海宁市| 浪卡子县| 镇远县| 平顶山市| 关岭| 十堰市| 惠水县| 鄂温| 大同县| 安图县| 天峨县| 昆明市| 巧家县| 白山市| 宁国市| 济宁市| 吴堡县| 儋州市| 南澳县| 甘孜县| 长兴县| 天峻县| 洛隆县| 鹤庆县| 万安县| 山丹县|