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動物細胞培養(yǎng):細胞凍存與復蘇

來源:上海邦奕商貿有限公司   2012年06月07日 17:42  

 細胞凍存是細胞保存的主要方法之一。利用凍存技術將細胞置于一196~C液氮中低溫保存,可以使細胞暫時脫離生長狀態(tài)而將其細胞特性保存起來,這樣在需要的時候再復蘇細胞用于實驗。而且適度地保存一定量的細胞,可以防止因正在培養(yǎng)的細胞被污染或其他意外事件而使細胞丟種,起到了細胞保種的作用。除此之外,還可以利用細胞凍存的形式來購買、寄贈、交換和運送某些細胞。 細胞凍存時向培養(yǎng)基中加入保護劑--終濃度5%.15%的甘油或二甲基亞砜(DMSO),可使溶液冰點降低,加之在緩慢凍結條件下,細胞內水分透出,減少了冰晶形成,從而避免細胞損傷。 采用"慢凍快融"的方法能較好地保證細胞存活。標準冷凍速度開始為-1 到 -2℃/min,當溫度低于-25℃時可加速,到-80℃之后可直接投入液氮內(-196℃)。復蘇細胞時則直接將裝有細胞的凍存管投入40℃熱水中迅速解凍。

材料:凍存管,離心管,細胞培養(yǎng)用材料,500 mL燒杯,膠布,搪瓷杯,75%酒精棉。

藥品:培養(yǎng)基(RPMI1640或DMEM),小牛血清,0.25%胰蛋白酶溶液,二甲基亞砜(DMSO)或甘油,0.5%臺盼藍染液,液氮。

儀器:4℃冰箱,-70℃冰箱,液氮容器,微量加樣器,水浴鍋,離心機。

(一)細胞凍存

1.取待凍存的細胞用胰酶消化(見相關實驗細胞傳代培養(yǎng)部分),用培養(yǎng)基將細胞沖洗下來。800 r/min離心5 min,棄上清收集細胞。如果是懸浮生長的細胞,則可直接離心收集細胞。

2.加入適量凍存液(10%甘油+90%培養(yǎng)基,或者10%DMSO+90%培養(yǎng)基)制成細胞懸液。細胞濃度宜大,3×106個/mL左右,并可適量增加牛血清濃度至20%。

3.細胞懸液裝入凍存管中。用膠布封裹,做好標記(寫上細胞種類、時間及凍存條件等)。

4.凍存管在4℃下存放30 min,轉放-20℃ 1.5~2 h,再轉人-70℃ 4-12 h后即可轉移到液氮內(-196℃),注意進行登記。

(二)細胞復蘇

1.取一搪瓷杯盛上適量自來水加熱至40℃左右。

2.從液氮中取出凍存管立即投人40℃水中迅速解凍。

3.取出凍存管,用75%酒精清潔管口,打開。

4.離心去上清收集細胞,用無血清培養(yǎng)基洗1次,加人3 mL新鮮培養(yǎng)基,于小培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

5.每日觀察細胞生長情況,如果死細胞較多,復蘇次日應換液。待細胞長滿后可進行傳代培養(yǎng)。

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