隨著分子檢測的不斷發(fā)展，甲基化qPCR檢測以及甲基化NGS檢測已成為非常普及的檢測技術(shù)，這兩種技術(shù)的必經(jīng)之路就是甲基化轉(zhuǎn)化，甲基化轉(zhuǎn)化從方法學(xué)上可分為亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化和酶法轉(zhuǎn)化，近幾年，基于DNA甲基化位點(diǎn)的檢測試劑盒陸續(xù)獲批面世。NMPA批準(zhǔn)的甲基化檢測試劑盒大部分為熒光PCR法，主要原因在于熒光PCR法操作簡便，無需在PCR后電泳，且具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好等特點(diǎn)。這些甲基化檢測試劑采用的轉(zhuǎn)化方法為亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化法，亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化成為DNA甲基化檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”。但是傳統(tǒng)的亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化有很多局限性，例如過長的轉(zhuǎn)化時(shí)間、嚴(yán)重的DNA損傷、被高估的5mC水平、C-U轉(zhuǎn)化不全等。

圖1.亞硫酸氫鹽催化C轉(zhuǎn)化為U的化學(xué)反應(yīng)概要

2024年1月2日，芝加哥大學(xué)何川教授團(tuán)隊(duì)在Nature Biotechnology上在線發(fā)表了題為Ultrafast bisulfite sequencing detection of 5?methylcytosine in DNA and RNA的研究論文，該研究提出并開發(fā)了對(duì)DNA和RNA上的5-甲基胞嘧啶修飾進(jìn)行快速，準(zhǔn)確檢測的測序方法，簡稱為UBS-seq。該技術(shù)比現(xiàn)有的轉(zhuǎn)化反應(yīng)過程加速20-30倍，同時(shí)明顯的降低了DNA損傷，以及C-U轉(zhuǎn)化導(dǎo)致的背景干擾。

圖2.UBS-seq法在微量樣本中應(yīng)用，傳統(tǒng)BS轉(zhuǎn)化相比有更低的背景噪音

圖3.Superfast BS轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)流程

投入不同量的293gDNA，293gDNA參入0.5% λ DNA，使用12227（磁珠法）與競品1轉(zhuǎn)化試劑盒進(jìn)行頭對(duì)頭對(duì)比，同時(shí)采用雙鏈甲基化DNA建庫（12214ES），如圖4所示：12227（磁珠法）對(duì)不同投入量的DNA中 λ DNA C的轉(zhuǎn)化率≥99.5%，轉(zhuǎn)化時(shí)間適當(dāng)延長，能進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)化效率。

圖4.12227和競品的轉(zhuǎn)化率

10 ng cf DNA和50 ng FFPE DNA，cf DNA和FFPE DNA都參入0.5% λ DNA，使用12227（磁珠法）與競品1轉(zhuǎn)化試劑盒進(jìn)行頭對(duì)頭對(duì)比，同時(shí)采用雙鏈甲基化DNA建庫（12214ES），如圖5所示：12227（磁珠法）對(duì)不同樣本中 λ DNA C的轉(zhuǎn)化率≥99.5%，轉(zhuǎn)化時(shí)間適當(dāng)延長，能進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)化效率。

投入不同量的293 DNA，使用12225和12227與競品1轉(zhuǎn)化試劑盒進(jìn)行頭對(duì)頭對(duì)比，轉(zhuǎn)化后采用Qubit ssDNA定量，計(jì)算回收率，如圖6所示：12225的樣本回收率能穩(wěn)定達(dá)到60%以上，并且當(dāng)樣本量大于200 ng，回收率能超過70%，磁珠法轉(zhuǎn)化試劑在高投入量下，回收率略低于柱式法，1 μg以內(nèi)，磁珠法的回收率能達(dá)到60%。

備注：競品1為磁珠法

在微流控的自動(dòng)化單細(xì)胞DNA甲基化平臺(tái)上，進(jìn)行單細(xì)胞甲基化轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，樣本中單細(xì)胞DNA轉(zhuǎn)化率在99%左右。