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糖衍生化后的GC-MS分析(1)：分析挑戰(zhàn)和分析方法
糖是生物最原始的渴望之一，它攝入能為人體快速注入能量，它調(diào)和著充盈著味蕾，而過少或過量的攝入則會導(dǎo)致低血糖、糖尿病等...
糖作為一種和我們的日常生活及營養(yǎng)健康息息相關(guān)的成分，對它的有效分析無疑是一個長盛不衰的重要課題。糖分析方法有哪些？怎樣才能做到有效分析？對此，Restek 將以 4 篇干貨組成系列，與您一起系統(tǒng)探討糖分析的難點(diǎn)與要點(diǎn)。今天，我們?yōu)榇蠹規(guī)淼氖堑?1 部分——糖分析的挑戰(zhàn)及不同的分析方法。
01
糖分析的挑戰(zhàn)
Restek GC-MS Analysis
Restek 在評估 Rtx-225 的性能和選擇性時，查閱了許多使用 225 固定相的色譜柱分離衍生糖的論文，特別是分離醛糖醇的乙酯衍生物。糖關(guān)乎營養(yǎng)、醫(yī)學(xué)和能量等多個領(lǐng)域，與健康、安全和可持續(xù)性等主題密切相關(guān)。
考慮到糖分析的廣泛應(yīng)用，通用的衍生化方法非常值得關(guān)注。額外的化學(xué)反應(yīng)通常對研究人員來說是個麻煩，但對于糖來說卻是必要的。糖的極性很高，這使得用 LC 方法分離變得困難；同時糖又是非揮發(fā)性的，這又使之難以用 GC 方法進(jìn)行分離。通過衍生化，可以調(diào)整極性或揮發(fā)性，以提高 GC 和 LC 系統(tǒng)的性能。質(zhì)譜檢測器在分析未知的糖混合物時非常有用，但使用 LC 和 UV 或 RI 檢測器也可以不通過衍生完成糖的分析。
02
糖分析的 GC 方法
Restek GC-MS Analysis
對于 GC 分析，有各種衍生化方法，但最常見有甲硅烷基化或乙?；?979 年，Knapp 等人提出，三甲基硅烷基（TMS）衍生是分析糖的一個方法，盡管它們會產(chǎn)生多種異構(gòu)體并出現(xiàn)對應(yīng)色譜峰。
而 Haas 等人的最近的工作（2018）表明，在 TMS 或三氟乙?；═FA）衍生化之前添加肟化步驟可將異構(gòu)體（和色譜峰）的數(shù)量減少到只有兩個，并改善混合物的分離。Lv 等人（2015）也證明了在藥物化學(xué)中醛糖醇乙酸酯是優(yōu)選的衍生物。TFA- 或 TMS- 肟化方法對多種糖簡單有效，但會產(chǎn)生兩種異構(gòu)體（圖1），這可能會使定量復(fù)雜化。醛糖醇乙?；椒▋H會有效產(chǎn)生一個衍生物峰（圖1），但當(dāng)羰基還原為羥基時，多種糖可能會產(chǎn)生相同的衍生物，如阿拉伯糖和來蘇糖。
糖的鑒定是一個迷人而復(fù)雜的領(lǐng)域，在這一系列文章中，我們將重點(diǎn)研究幾種常見的、相對簡單的糖（鼠李糖、甘露糖、半乳糖、木糖、巖藻糖、葡萄糖、核糖、果糖和阿拉伯糖）的色譜性能，使用三種衍生方法：TMS 肟化、TFA 肟化和醛糖醇乙?；?。
圖1：各種葡萄糖衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)
03
如何通過 GC-MS 有效分析糖
Restek GC-MS Analysis
在這個系列文章中，我們將詳細(xì)介紹通過 GC-MS 分析糖的經(jīng)驗(yàn)。TMS- 和 TFA 肟化的方法是基于 Haas 等人所述的方法，而我們生成醛糖醇乙酸酯的方法則是 Reay 等人及 Englyst 等人所述方法的簡化組合。這三種方法都涉及兩步衍生化。正如預(yù)期的那樣，醛糖醇乙酸酯為每個衍生糖產(chǎn)生一個峰，而 TMS- 和 TFA 肟分別產(chǎn)生兩個峰。
表1：GC-MS 分析前糖衍生化的方法
醛糖醇乙酸酯 | TMS-肟 | TFA-肟 |
1. 將 2mg 糖溶于 60μL 的 10 mg/L Sodium borohydride的 n-甲基咪唑溶液和 250μL 水中，然后在 37℃ 下加熱 90 分鐘，然后用 20μL 冰醋酸終止反應(yīng)。 2. 讓樣品冷卻至室溫約 5 分鐘，加入 600 uL 乙酸酐，然后在 37℃ 下再次加熱 45 分鐘。 3. 通過冷凍樣品（-15℃） 15 分鐘來停止反應(yīng)。 4. 小心地通過滴加 2.5 毫升水來終止。 5. 用 2 mL 氯仿（下層）萃取三次，合并，蒸發(fā)至干，然后用 1.5 mL 氯仿復(fù)溶。醛糖醇乙酸酯衍生物的最終濃度應(yīng)為約 1.33 mg/mL。 | 1. 將 2mg 糖溶于 200 uL 的 40 mg/mL 環(huán)氧乙烷的吡啶溶液中，并在 70℃ 下加熱 30 分鐘。 2. 讓樣品冷卻至室溫約 5 分鐘，然后加入 120 uL BSTFA，并在 70℃ 下加熱 30 分鐘。 3. 在 320 uL 乙酸乙酯中稀釋，使 TMS 肟在乙酸乙酯中的最終濃度約為 3.125 mg/mL。 | 1. 將 2mg 糖溶于 200 uL 的 40 mg/mL 環(huán)氧乙烷的吡啶溶液中，并在 70℃ 下加熱 30 分鐘。 2. 讓樣品冷卻至室溫約 5 分鐘，然后加入120 uL MBTFA，并在 70℃ 下加熱 30 分鐘。 3. 在 320 uL 乙酸乙酯中稀釋，使 TFA 肟在乙酸乙酯中的最終濃度約為 3.125 mg/mL。 |
BSTFA 和 MBTFA 對水十分敏感。而糖是吸濕性的，很容易從空氣中吸收水分，因此所有樣品在分析前都要儲存在干燥器中。我們使用 BSTFA 的衍生化很成功，但在進(jìn)行 MBTFA 衍生時遇到了問題。對此的推測是，在 MBTFA 衍生方面的困難與樣品或試劑中存在水有關(guān)，我們再添加 30-60 mg 5A，8/12 的粉碎分子篩（在 300℃ 下活化 2 小時，然后冷卻至室溫）。分子篩改善了 MBTFA 的衍生化，但似乎降低了峰高——這可能是由于衍生糖中除了存在的水之外還存在一些其它問題。將分子篩用于定量方法還需要更多的驗(yàn)證工作，但它對于定性目的是有效的。
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