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細(xì)胞復(fù)蘇失敗原因分析——凍存篇

來源:武漢尚恩生物技術(shù)有限公司   2025年02月06日 10:12  

最近經(jīng)常有同學(xué)和小尚反映細(xì)胞復(fù)蘇不起來,復(fù)蘇是細(xì)胞培養(yǎng)的一個常規(guī)操作,但其中有諸多細(xì)節(jié)容易被忽視,復(fù)蘇成敗和凍存、復(fù)蘇操作都密切相關(guān),稍不注意就可能一失足成千古恨。


本篇主要從凍存角度進(jìn)行分析,下周將更新復(fù)蘇操作的原因排查,歡迎同學(xué)們收藏追更~



我們先復(fù)習(xí)一下凍存步驟:

1. 提前準(zhǔn)備好凍存液備用;

2. 離心獲得細(xì)胞沉淀后,加凍存液輕輕重懸細(xì)胞;

3. 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移入凍存管;

4. 如果使用程序凍存液,將凍存管放進(jìn)程序凍存盒,放入-80℃冰箱過夜后液氮保存。如果使用非程序凍存液,則無需凍存盒。



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凍存常見的錯誤操作





1. 使用常規(guī)含血清凍存液(培養(yǎng)基+血清+DMSO)時,沒有使用程序降溫凍存盒或泡沫盒等保溫措施。

降溫過快形成冰晶將導(dǎo)致細(xì)胞破裂死亡,常規(guī)含血清凍存液需要搭配凍存盒使用。現(xiàn)在市售的程序凍存盒可以確保溫度以1℃/min的速度緩慢下降。

沒有凍存盒的同學(xué)可以將凍存管放在泡沫盒中4℃靜置5-10min,再-20℃靜置2h后轉(zhuǎn)入-80℃過夜,第二天轉(zhuǎn)入液氮保存。

沒有凍存盒也沒有泡沫盒的同學(xué),建議用無血清非程序凍存液。非程序凍存液含有更多的保護(hù)劑,可以直接重懸細(xì)胞后置于-80℃冰箱過夜后轉(zhuǎn)入液氮。


2. 凍存前細(xì)胞狀態(tài)不好或凍存密度太低。

細(xì)胞狀態(tài)良好是復(fù)蘇成功前提,我們選擇對數(shù)生長期、匯合度80%以上的細(xì)胞進(jìn)行凍存。如果凍存前細(xì)胞培養(yǎng)上清呈橘黃色,建議換液后靜置培養(yǎng)4h再凍存。

雖然凍存液含有保護(hù)劑,但冷凍過程中仍會有少量細(xì)胞死亡。因此凍存的密度不能太低,以200-300萬/mL/管為宜。如果不方便計(jì)數(shù),可以按一個T25瓶凍存1-2管,一個10cm皿凍存2-3管(注意細(xì)胞是80%以上匯合度)。


3. 直接將DMSO加入細(xì)胞懸液而沒有提前配制凍存液

DMSO被稀釋時會放熱(好奇的同學(xué)下次配凍存液可以摸一下,小編也是偶然摸了才發(fā)現(xiàn)的),會對較脆弱的細(xì)胞造成損傷。好養(yǎng)的細(xì)胞也許沒有很大影響,但為了課題順利,咱還是不能偷懶哈~先配好凍存液,再去處理細(xì)胞。


4. 凍存液重懸細(xì)胞后直接放進(jìn)液氮,沒有經(jīng)過-80℃冰箱

液氮的溫度是-196℃,未經(jīng)梯度降溫的細(xì)胞直接放進(jìn)液氮,毫無疑問細(xì)胞會死亡。將細(xì)胞放液氮罐口降溫也不行哈。


5. 凍存液配方不合適

研究表明5%-10%的DMSO 適合細(xì)胞凍存,具體比例要根據(jù)細(xì)胞種類調(diào)整,對DMSO敏感的細(xì)胞則需要降低比例。根據(jù)小尚的經(jīng)驗(yàn),8% DMSO適用于大部分細(xì)胞系。

同時,還需根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)難度調(diào)整血清比例,越難養(yǎng)的細(xì)胞越要多加血清,過于脆弱的細(xì)胞可用血清+DMSO凍存,不加培養(yǎng)基。

無論用何種凍存液,都建議做凍檢再正式凍存:即凍存24h后復(fù)蘇一支,確認(rèn)細(xì)胞狀態(tài)沒問題,即可進(jìn)行大批量凍存。凍檢成功前要留至少一瓶細(xì)胞培養(yǎng),以免復(fù)蘇失敗導(dǎo)致細(xì)胞絕種。


6. 凍存條件不當(dāng)或凍存時間太久

通常,液氮儲存的時限和穩(wěn)定性比-80℃冰箱要好很多。-80℃冰箱由于經(jīng)常會開關(guān)門,溫度不夠穩(wěn)定,導(dǎo)致細(xì)胞活率下降比較快,因此細(xì)胞盡量液氮保存。

沒有液氮罐的同學(xué),把凍存管放在-80℃冰箱靠里面的位置,定期復(fù)蘇檢測活性。



未完待續(xù)......



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