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細胞復(fù)蘇失敗原因分析——復(fù)蘇篇

來源:武漢尚恩生物技術(shù)有限公司   2025年02月06日 10:21  

細胞復(fù)蘇成敗和凍存及復(fù)蘇操作密切相關(guān)。上個星期和大家分享了細胞凍存方面容易出錯的細節(jié),詳見《細胞復(fù)蘇失敗原因分析——凍存篇》。本篇主要從復(fù)蘇角度分析,排查復(fù)蘇過程中容易出現(xiàn)的問題。




復(fù)蘇步驟

同樣,我們先復(fù)習(xí)一下復(fù)蘇步驟:

1. 提前將水浴鍋預(yù)熱至37℃,培養(yǎng)基復(fù)溫,離心機設(shè)置好轉(zhuǎn)速;

2. 準備一個15ml離心管并加入適量培養(yǎng)基。

3. 取出凍存管,浸入水浴鍋迅速搖晃使細胞在2min內(nèi)充分融化;

4. 將細胞懸液緩慢滴入提前加了培養(yǎng)基的離心管,1000rpm 3min離心;

5. 棄上清,重懸細胞并接種至培養(yǎng)器皿中,放入培養(yǎng)箱。






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復(fù)蘇常見的錯誤操作

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1. 若液氮或冰箱距離水浴鍋較遠,沒有做保冷措施

為防止細胞在運輸路上開始融化(特別是夏季),凍存細胞需要放在干冰或冰盒上運送至水浴鍋。


2. 運輸凍存管時手觸碰到細胞部分或放在了口袋里

請勿用手觸碰凍存管身,避免局部溫度升高導(dǎo)致細胞開始融化。應(yīng)捏住管蓋或放在容器中運輸


3. 采用錯誤的方式融化細胞

不要用手捂化(搓熱也不行),手心溫度不夠高,細胞受熱不均勻且降溫速度太慢導(dǎo)致細胞死亡。


4. 水浴時沒有嚴格控制時間,直接放水里靜置,沒有晃動促進融化

細胞復(fù)蘇需遵循“快融”原則,建議在2min內(nèi)將細胞充分融化,水浴時間越長活率越低。比較好的方法是捏住管蓋,將管身浸沒水中快速搖晃,促進細胞融化。切忌將凍存管靜置在水浴中。


5. 水浴結(jié)束時管內(nèi)還有較大冰塊

如果沒融化完quan,還有比較大的冰塊,也會導(dǎo)致細胞死亡。一方面冰塊中的細胞緩慢升溫而死亡,另一方面冰塊導(dǎo)致已融化的細胞被低溫損傷。

有的同學(xué)說2min的水浴很難讓細胞融化,那么咱們可以將水浴鍋溫度提高至39度(小編親測可行),搖晃速度加快,擔(dān)心污染可以將凍存管放在一次性PE手套內(nèi)再進行水浴。水浴鍋里的水不能太少,否則凍存管放入水后局部溫度會達不到預(yù)設(shè)溫度,導(dǎo)致融化過慢。


6. 細胞融化后沒有離心去除DMSO

有的同學(xué)復(fù)蘇細胞會在細胞融化后加10倍培養(yǎng)基稀釋,不離心直接培養(yǎng),等細胞貼壁后換液。雖然這對于好養(yǎng)的貼壁細胞是可行的,但不是長遠之計,也不適用于懸浮細胞。DMSO對細胞有一定毒性,有些細胞對DMSO比較敏感,如HL-60細胞等。如果你不清楚自己的細胞是否對DMSO敏感,那么還是離心去除上清最為保險。


以上由小尚多年經(jīng)驗總結(jié)而來,結(jié)合凍存篇,基本可以解決所有復(fù)蘇失敗的問題。如果還有沒提及的知識點,歡迎同學(xué)們可以在評論區(qū)補充~


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