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實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的基本原理是利用DNA聚合酶在PCR過程中合成新DNA鏈的特性，結(jié)合一種熒光標(biāo)記的探針或染料，通過實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的增加來測(cè)量PCR反應(yīng)的進(jìn)行程度。在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基因，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程。隨著反應(yīng)時(shí)間的進(jìn)行，監(jiān)測(cè)到的熒光信號(hào)的變化可以繪制成一條曲線。
由于在PCR擴(kuò)增的指數(shù)時(shí)期，模板的Ct值(即樣品到達(dá)域值水平所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，所以可以作為定量的依據(jù)。域值應(yīng)設(shè)定在使指數(shù)期的擴(kuò)增效率為最大，這樣可以獲得最準(zhǔn)確、可重復(fù)性的數(shù)據(jù)。如果同時(shí)擴(kuò)增的還有標(biāo)有相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，線性回歸分析將產(chǎn)生一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以用來計(jì)算未知樣品的濃度。
使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的一般操作流程包括：
設(shè)計(jì)引物和探針：根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，選擇合適的基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物和熒光探針。
準(zhǔn)備樣本：提取待檢測(cè)的核酸樣本，如DNA或RNA，并確保樣本的質(zhì)量和純度。
準(zhǔn)備反應(yīng)體系：將所需的試劑和樣本加入PCR反應(yīng)管中，組成反應(yīng)體系。包括引物、探針、酶、緩沖液、dNTPs和核酸模板等。
設(shè)置儀器參數(shù)：打開儀器，選擇合適的PCR程序，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求設(shè)置溫度、時(shí)間、循環(huán)次數(shù)等參數(shù)。同時(shí)，設(shè)置熒光檢測(cè)通道和參數(shù)。
放置樣本：將準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管放入儀器的樣品槽中，確保放置正確且穩(wěn)固。
啟動(dòng)程序：確認(rèn)設(shè)置無誤后，啟動(dòng)PCR程序。儀器將按照設(shè)定參數(shù)進(jìn)行溫度循環(huán)和熒光檢測(cè)。
實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)與分析：通過儀器顯示屏實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)變化，觀察擴(kuò)增曲線形狀和趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，儀器自動(dòng)生成結(jié)果，包括擴(kuò)增曲線、Ct值等。使用軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析和處理。
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