實時熒光定量PCR儀的基本原理是利用DNA聚合酶在PCR過程中合成新DNA鏈的特性,結合一種熒光標記的探針或染料,通過實時監(jiān)測熒光信號的增加來測量PCR反應的進行程度。在PCR反應體系中加入熒光基因,利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程。隨著反應時間的進行,監(jiān)測到的熒光信號的變化可以繪制成一條曲線。
由于在PCR擴增的指數(shù)時期,模板的Ct值(即樣品到達域值水平所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關系,所以可以作為定量的依據(jù)。域值應設定在使指數(shù)期的擴增效率為最大,這樣可以獲得最準確、可重復性的數(shù)據(jù)。如果同時擴增的還有標有相應濃度的標準品,線性回歸分析將產生一條標準曲線,可以用來計算未知樣品的濃度。
使用實時熒光定量PCR儀的一般操作流程包括:
設計引物和探針:根據(jù)實驗目的,選擇合適的基因序列,設計特異性引物和熒光探針。
準備樣本:提取待檢測的核酸樣本,如DNA或RNA,并確保樣本的質量和純度。
準備反應體系:將所需的試劑和樣本加入PCR反應管中,組成反應體系。包括引物、探針、酶、緩沖液、dNTPs和核酸模板等。
設置儀器參數(shù):打開儀器,選擇合適的PCR程序,并根據(jù)實驗要求設置溫度、時間、循環(huán)次數(shù)等參數(shù)。同時,設置熒光檢測通道和參數(shù)。
放置樣本:將準備好的PCR反應管放入儀器的樣品槽中,確保放置正確且穩(wěn)固。
啟動程序:確認設置無誤后,啟動PCR程序。儀器將按照設定參數(shù)進行溫度循環(huán)和熒光檢測。
實時監(jiān)測與分析:通過儀器顯示屏實時監(jiān)測熒光信號變化,觀察擴增曲線形狀和趨勢。實驗結束后,儀器自動生成結果,包括擴增曲線、Ct值等。使用軟件對結果進行分析和處理。
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