常用的方法有Northern印跡雜交,斑點(diǎn)印跡雜交,RT-PCR,原位雜交與原位PCR,RNA半壽期的檢測(cè),進(jìn)行中的轉(zhuǎn)錄分析(run。nassay)等。
(一)Northern印跡雜交
將RNA變性及電泳分離后,將其轉(zhuǎn)移到固相支持物(如尼龍膜)上,再用某一細(xì)胞因子的標(biāo)記核酸探針雜交,以檢測(cè)相應(yīng)細(xì)胞因子mRNA的分子量及其在細(xì)胞內(nèi)的積累量。
細(xì)胞因子大都是在某種刺激因素的影響下,使其mRNA轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng),從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)mRNA積累增加。但用細(xì)胞總RNA作Northern印跡雜交,其結(jié)果不能*反映mRNA的轉(zhuǎn)錄活性,因?yàn)閙RNA的穩(wěn)定性及其降解速率直接影響細(xì)胞內(nèi)mRNA的積累量。
(二)斑點(diǎn)及狹縫印跡雜交
原理同上。只是用RNA替代DNA點(diǎn)樣在膜上,其變性方法與DNA不同。
(三)反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)
細(xì)胞因子的mRNA壽命短且拷貝數(shù)低,因此難以在小量樣本中進(jìn)行檢測(cè)。RT-PCR是一種能檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)低豐度特異RNA的方法,其原理是首先以RNA為模板,在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下,合成與RNA互補(bǔ)的cDNA。然后以cDNA為模板,用PCR技術(shù)對(duì)靶序列進(jìn)行擴(kuò)增,使微量細(xì)胞因子的RNA經(jīng)放大后檢出。RT-PCR能檢出單個(gè)細(xì)胞中少于10個(gè)拷貝的特異RNA,如同時(shí)放大內(nèi)參照物,即可對(duì)RT-PCR檢出的細(xì)胞因子mRNA進(jìn)行定量。
(四)原位雜交及原位RT-PCR
原位雜交的原理基本同上,僅是在組織細(xì)胞切片上,用標(biāo)記的核酸探針檢測(cè)胞漿內(nèi)的特異mRNA;而檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)低拷貝mRNA的方法則用原位反轉(zhuǎn)錄PCR。
(五)mRNA半壽期的測(cè)定
mRNA半壽期的長(zhǎng)短直接影響細(xì)胞內(nèi)mRNA的積累量。其測(cè)定原理是利用放線菌素D(10ug/mL)可阻斷新的mRNA的轉(zhuǎn)錄,在轉(zhuǎn)錄停止后的不同時(shí)間提取總RNA,通過Northem印跡雜交及掃描定量,確定阻斷前已轉(zhuǎn)錄的mRNA隨著時(shí)間遷移的衰減程度,以mRNA降解到原有mRNA的50%所需要的時(shí)間為該mRNA的半壽期。
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