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干貨 | 雙熒光素酶驗(yàn)證miRNA與靶基因3’UTR相互作用！
在miRNA 的研究中經(jīng)常會(huì)涉及到miRNA 與基因靶向關(guān)系的驗(yàn)證，miRNA 通過(guò)其種子序列（5’端第2-8 個(gè)堿基）靶向結(jié)合mRNA 的3’UTR 區(qū)，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)沉默復(fù)合體介導(dǎo)的mRNA降解或阻遏mRNA 的翻譯過(guò)程?；谝陨显恚鐖D，將目的基因3'UTR 區(qū)（或結(jié)合位點(diǎn)下游500bp）插入到熒光素酶報(bào)告基因載體luciferase 下游，與miRNA mimics 共轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞，加入底物，檢測(cè)熒光素酶活性的變化。若熒光素酶活性下調(diào)，則該miRNA 與靶基因3'UTR 區(qū)存在相互作用。
常用載體：PGL3-CMV-LUC-MCS
圖1.miRNA與3‘UTR報(bào)告基因原理示意圖
雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)用于驗(yàn)證miRNA與靶基因3'UTR的相互作用的工作原理主要基于以下幾個(gè)步驟：
miRNA靶基因的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)
利用生物信息學(xué)分析軟件（如TargetScan、StarBase和miRanda等）來(lái)分析特定靶基因的3'-UTR區(qū)序列是否有miRNA結(jié)合位點(diǎn)。
將預(yù)測(cè)能夠與miRNA結(jié)合的靶基因3'-UTR序列插入載體中螢火蟲(chóng)熒光素酶（Firefly luciferase）的3'-UTR。當(dāng)miRNA和質(zhì)粒中的插入序列結(jié)合后，miRNA會(huì)通過(guò)和所插入的序列結(jié)合從而抑制螢火蟲(chóng)熒光素酶的翻譯，最終造成熒光值的降低。
miRNA/靶基因間相互作用的結(jié)構(gòu)學(xué)驗(yàn)證
miRNA與靶基因的作用機(jī)制
實(shí)驗(yàn)步驟
結(jié)果分析
通過(guò)上述步驟，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)可以有效地驗(yàn)證miRNA與靶基因3'UTR的相互作用，為研究miRNA的功能和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供重要工具。
翌圣雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)服務(wù)流程：
詳細(xì)操作步驟：
材料與準(zhǔn)備
細(xì)胞HEK 293 細(xì)胞或目的細(xì)胞
轉(zhuǎn)染試劑：可選Hieff Trans® in vitro siRNA/miRNA Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑（貨號(hào)：40806ES）
報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒：Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit 雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：11402ES）
其他儀器耗材酶標(biāo)儀、細(xì)胞培養(yǎng)板等
實(shí)驗(yàn)步驟
目的細(xì)胞質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)預(yù)實(shí)驗(yàn)
當(dāng)選擇在目的細(xì)胞（而非293 工具細(xì)胞）中進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)時(shí)，首先要確認(rèn)目的細(xì)胞的質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)效率，以及摸索合適的瞬轉(zhuǎn)體系，質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)效率>40%以上時(shí)表明預(yù)實(shí)驗(yàn)通過(guò)。
轉(zhuǎn)染正式實(shí)驗(yàn)
a. 將狀態(tài)良好，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的空白細(xì)胞用0.25%胰酶消化，用培養(yǎng)基懸浮成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，接種于24 孔培養(yǎng)板中；
b. 培養(yǎng)過(guò)夜，觀(guān)察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。在細(xì)胞覆蓋率70%左右時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)；
c. 轉(zhuǎn)染2 h 前換液為新鮮的培養(yǎng)基；
d. 轉(zhuǎn)染取無(wú)菌的1.5 mL EP 管，轉(zhuǎn)染參考轉(zhuǎn)染試劑使用說(shuō)明書(shū)；
e. 轉(zhuǎn)染48 h 后收集細(xì)胞樣品。
A 細(xì)胞樣品收集
a. 轉(zhuǎn)染后從培養(yǎng)箱中取靶細(xì)胞，輕輕吸凈培養(yǎng)液，PBS 洗滌2 次；
b. 棄去PBS，每孔加入100 μL 的1×PLB（5X Passive Lysis Buffer 用無(wú)菌水稀釋而得）；
c. 細(xì)胞裂解后，將樣品轉(zhuǎn)移入EP 管中，-80 度冰箱保存。
B 根據(jù)報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行檢測(cè)
a. 將充分裂解后的裂解產(chǎn)物，10,000-15,000 rpm 離心3-5 min。離心后將上清液移入新的
EP 管進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。
b. Renilla Luciferase Assay 工作液的配置：按照樣品要求的量，將Renilla Luciferase Assay
Reagent(100×)按照稀釋比例加入Renilla Luciferase Assay buffer，混勻后室溫放置。
c. 熒光素酶檢測(cè)
按照儀器說(shuō)明書(shū)要求將熒光檢測(cè)打開(kāi)，設(shè)定參數(shù)，測(cè)定時(shí)間為10 s，測(cè)定間隔為2 s；
將樣品按照20 μL 的體積加入測(cè)量管中（保持每次樣品的加樣量一致），
另外加入20 μL Firefly Luciferase Assay Reagent 混勻2-3 次（不能漩渦混勻），充分混勻后
測(cè)定RLU（Relative light unit），同時(shí)設(shè)置Cell Lysis buffer 為空白對(duì)照孔；
將檢測(cè)后的樣品，加入20 μL 配制的Renilla Luciferase Assay 工作液混勻2-3 次，充分
混勻后測(cè)定RLU，同時(shí)設(shè)置Renilla Luciferase Assay 工作液為空白對(duì)照孔。
常規(guī)檢測(cè)分組
（1）mimics NC+對(duì)照質(zhì)粒+海腎內(nèi)參（TK)；
（2）mimics NC+ 3’UTR 野生型質(zhì)粒+海腎內(nèi)參（TK）；
（3）mimics NC+ 3’UTR 突變型質(zhì)粒+海腎內(nèi)參（TK)；
（4）mimics+對(duì)照質(zhì)粒+海腎內(nèi)參（TK)；
（5）mimics+3’UTR 野生型質(zhì)粒（WT）+海腎內(nèi)參（TK)；
（6）mimics+3’UTR 突變型質(zhì)粒（MT）+海腎內(nèi)參（TK)。
實(shí)驗(yàn)預(yù)期結(jié)果
翌圣可提供雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)服務(wù)，加快基礎(chǔ)研究及藥物篩選進(jìn)度
相關(guān)產(chǎn)品清單：
產(chǎn)品類(lèi)別 | 產(chǎn)品名稱(chēng) | 產(chǎn)品貨號(hào) | 產(chǎn)品規(guī)格 |
雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑 | Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit 雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒 | 11402ES60/80 | 100T/1000T |
Dual One Step Luciferase Reporter Gene Assay Kit 輝光型雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒 | 11405ES60/80 | 100T/1000T | |
轉(zhuǎn)染試劑 | Hieff Trans® Liposomal Transfection Reagent 轉(zhuǎn)染試劑 | 40802ES01/03 | 100μL/1mL |
Hieff Trans® in vitro siRNA/miRNA Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑 | 40806ES01/02/03 | 0.1mL/0.5mL /1mL | |
Hieff Trans® mRNA Transfection Reagent 轉(zhuǎn)染試劑 | 40809ES01/03 | 0.1mL/1mL |
相關(guān)產(chǎn)品
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