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干貨 | 雙熒光素酶驗證miRNA與靶基因3’UTR相互作用!

來源:翌圣生物科技(上海)股份有限公司   2025年03月19日 08:54  

在miRNA 的研究中經(jīng)常會涉及到miRNA 與基因靶向關(guān)系的驗證,miRNA 通過其種子序列(5’端第2-8 個堿基)靶向結(jié)合mRNA 的3’UTR 區(qū),誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)沉默復(fù)合體介導(dǎo)的mRNA降解或阻遏mRNA 的翻譯過程?;谝陨显?,如圖,將目的基因3'UTR 區(qū)(或結(jié)合位點下游500bp)插入到熒光素酶報告基因載體luciferase 下游,與miRNA mimics 共轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞,加入底物,檢測熒光素酶活性的變化。若熒光素酶活性下調(diào),則該miRNA 與靶基因3'UTR 區(qū)存在相互作用。

 

常用載體:PGL3-CMV-LUC-MCS

圖1.miRNA與3‘UTR報告基因原理示意圖

 

雙熒光素酶報告基因檢測用于驗證miRNA與靶基因3'UTR的相互作用的工作原理主要基于以下幾個步驟

 
 

miRNA靶基因的生物信息學(xué)預(yù)測

利用生物信息學(xué)分析軟件(如TargetScan、StarBase和miRanda等)來分析特定靶基因的3'-UTR區(qū)序列是否有miRNA結(jié)合位點。

 
 
構(gòu)建報告基因載體

將預(yù)測能夠與miRNA結(jié)合的靶基因3'-UTR序列插入載體中螢火蟲熒光素酶(Firefly luciferase)的3'-UTR。當(dāng)miRNA和質(zhì)粒中的插入序列結(jié)合后,miRNA會通過和所插入的序列結(jié)合從而抑制螢火蟲熒光素酶的翻譯,最終造成熒光值的降低。

 
 

miRNA/靶基因間相互作用的結(jié)構(gòu)學(xué)驗證

通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灴梢岳斫鉃橥ㄟ^熒光值來判斷miRNA是否與靶基因結(jié)合。如果miRNA與插入到質(zhì)粒中的目標(biāo)序列發(fā)生結(jié)合,miRNA將通過抑制該序列的翻譯來降低螢火蟲熒光素酶的表達,進而導(dǎo)致熒光強度的下降。這一變化可以作為miRNA與靶基因結(jié)合的指標(biāo)。
 
 

miRNA與靶基因的作用機制

miRNA的基本作用機制有兩種:抑制蛋白翻譯和通過不全的miRNA-mRNA互補配對誘導(dǎo)靶RNA降解。miRNA通常與mRNA的3'UTR區(qū)域發(fā)生結(jié)合,通過這種方式發(fā)揮其生物學(xué)功能。
 
 

實驗步驟

構(gòu)建含靶基因3'UTR的雙熒光素酶報告基因載體,合成miRNA mimics和miRNA negative control,將載體和miRNA共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中,最后進行雙熒光素酶檢測以確定目的miRNA的靶基因。
 
 

結(jié)果分析

實驗中,如果miRNA能夠與靶基因結(jié)合,熒光值會顯著性下降。如果結(jié)合位點發(fā)生突變,miRNA無法與突變后的靶基因結(jié)合,熒光值與未突變的對照組無顯著性差異,從而驗證miRNA與靶基因的結(jié)合位點。

 

通過上述步驟,雙熒光素酶報告基因檢測可以有效地驗證miRNA與靶基因3'UTR的相互作用,為研究miRNA的功能和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供重要工具。

 

 

翌圣雙熒光素酶報告基因檢測服務(wù)流程:

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 

 

詳細(xì)操作步驟:

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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材料與準(zhǔn)備

 
  • 細(xì)胞HEK 293 細(xì)胞或目的細(xì)胞

  • 轉(zhuǎn)染試劑:可選Hieff Trans® in vitro siRNA/miRNA Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑(貨號:40806ES)

  • 報告基因檢測試劑盒:Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit 雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒(貨號:11402ES)

  • 其他儀器耗材酶標(biāo)儀、細(xì)胞培養(yǎng)板等

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實驗步驟

 
 
01
 

目的細(xì)胞質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)預(yù)實驗

當(dāng)選擇在目的細(xì)胞(而非293 工具細(xì)胞)中進行驗證實驗時,首先要確認(rèn)目的細(xì)胞的質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)效率,以及摸索合適的瞬轉(zhuǎn)體系,質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)效率>40%以上時表明預(yù)實驗通過。

02
 

轉(zhuǎn)染正式實驗

a. 將狀態(tài)良好,處于對數(shù)生長期的空白細(xì)胞用0.25%胰酶消化,用培養(yǎng)基懸浮成單細(xì)胞懸液,細(xì)胞計數(shù)后,接種于24 孔培養(yǎng)板中;

b. 培養(yǎng)過夜,觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。在細(xì)胞覆蓋率70%左右時,進行轉(zhuǎn)染實驗;

c. 轉(zhuǎn)染2 h 前換液為新鮮的培養(yǎng)基;

d. 轉(zhuǎn)染取無菌的1.5 mL EP 管,轉(zhuǎn)染參考轉(zhuǎn)染試劑使用說明書;

e. 轉(zhuǎn)染48 h 后收集細(xì)胞樣品。

03
 
報告基因檢測

A 細(xì)胞樣品收集

a. 轉(zhuǎn)染后從培養(yǎng)箱中取靶細(xì)胞,輕輕吸凈培養(yǎng)液,PBS 洗滌2 次;

b. 棄去PBS,每孔加入100 μL 的1×PLB(5X Passive Lysis Buffer 用無菌水稀釋而得);

c. 細(xì)胞裂解后,將樣品轉(zhuǎn)移入EP 管中,-80 度冰箱保存。

 

B 根據(jù)報告基因檢測試劑盒說明書操作進行檢測

a. 將充分裂解后的裂解產(chǎn)物,10,000-15,000 rpm 離心3-5 min。離心后將上清液移入新的

EP 管進行后續(xù)檢測。

b. Renilla Luciferase Assay 工作液的配置:按照樣品要求的量,將Renilla Luciferase Assay

Reagent(100×)按照稀釋比例加入Renilla Luciferase Assay buffer,混勻后室溫放置。

c. 熒光素酶檢測

按照儀器說明書要求將熒光檢測打開,設(shè)定參數(shù),測定時間為10 s,測定間隔為2 s;

將樣品按照20 μL 的體積加入測量管中(保持每次樣品的加樣量一致),

另外加入20 μL Firefly Luciferase Assay Reagent 混勻2-3 次(不能漩渦混勻),充分混勻后

測定RLU(Relative light unit),同時設(shè)置Cell Lysis buffer 為空白對照孔;

將檢測后的樣品,加入20 μL 配制的Renilla Luciferase Assay 工作液混勻2-3 次,充分

混勻后測定RLU,同時設(shè)置Renilla Luciferase Assay 工作液為空白對照孔。

04
 
數(shù)據(jù)處理與分析,計算相對熒光強度

 

05
 
提供原始數(shù)據(jù)及完整性實驗報告

 

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常規(guī)檢測分組

 

(1)mimics NC+對照質(zhì)粒+海腎內(nèi)參(TK);

(2)mimics NC+ 3’UTR 野生型質(zhì)粒+海腎內(nèi)參(TK);

(3)mimics NC+ 3’UTR 突變型質(zhì)粒+海腎內(nèi)參(TK);

(4)mimics+對照質(zhì)粒+海腎內(nèi)參(TK);

(5)mimics+3’UTR 野生型質(zhì)粒(WT)+海腎內(nèi)參(TK);

(6)mimics+3’UTR 突變型質(zhì)粒(MT)+海腎內(nèi)參(TK)。

 

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實驗預(yù)期結(jié)果

 

 

 

翌圣可提供雙熒光素酶報告基因檢測服務(wù),加快基礎(chǔ)研究及藥物篩選進度

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 

 

 

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產(chǎn)品類別

產(chǎn)品名稱

產(chǎn)品貨號

產(chǎn)品規(guī)格

雙熒光素酶報告基因檢測試劑

Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit 雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒

11402ES60/80

100T/1000T

Dual One Step Luciferase Reporter Gene Assay Kit 輝光型雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒

11405ES60/80

100T/1000T

轉(zhuǎn)染試劑

Hieff Trans® Liposomal Transfection Reagent 轉(zhuǎn)染試劑

40802ES01/03

100μL/1mL

Hieff Trans® in vitro siRNA/miRNA Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑

40806ES01/02/03

0.1mL/0.5mL /1mL

Hieff Trans® mRNA Transfection Reagent 轉(zhuǎn)染試劑

40809ES01/03

0.1mL/1mL


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