Biocolor F2000 彈性蛋白檢測(cè)試劑盒科研應(yīng)用指南

——定量組織與細(xì)胞外基質(zhì)中彈性蛋白的精準(zhǔn)方案

一、檢測(cè)原理與產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)

1.1 比色法檢測(cè)機(jī)制

特異性結(jié)合：試劑含 磺酸化四唑鎓鹽，與彈性蛋白的 非極性氨基酸殘基（如Val, Pro, Gly）選擇性結(jié)合，形成 紫色復(fù)合物（λmax=513nm）。

動(dòng)態(tài)范圍：0.2-50 μg彈性蛋白/樣本（R2>0.99），靈敏度 0.1 μg（優(yōu)于ELISA法）。

1.2 試劑盒核心組分

組分編號(hào) 名稱 作用與特性

F2000-A 提取緩沖液 含0.25M NH?OH，溶解交聯(lián)彈性纖維

F2000-B 染色試劑 避光保存，反應(yīng)后OD值與濃度呈線性

F2000-C 洗滌液 含0.1% SDS，降低非特異性吸附

1.3 適用樣本類型

推薦樣本：

? 皮膚/血管組織勻漿（建議≤50mg濕重）

? 細(xì)胞培養(yǎng)上清（需10倍濃縮）

? 病理切片（需配合顯微分光光度計(jì)）

二、標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)流程

2.1 樣本前處理

組織提取協(xié)議：

復(fù)制

1. 取20mg組織加入500μL F2000-A  

2. 95℃加熱2小時(shí)（釋放交聯(lián)彈性蛋白）  

3. 12,000g離心10分鐘，取上清檢測(cè)  

細(xì)胞樣本處理：

使用 F2000-A 裂解后，需通過 10kDa超濾管 濃縮

2.2 檢測(cè)步驟

復(fù)制

1. 加樣：  

  - 標(biāo)準(zhǔn)品/樣本各100μL至96孔板（建議復(fù)孔）  

2. 染色：  

  - 加入50μL F2000-B，37℃避光振蕩30min  

3. 洗滌：  

  - 用F2000-C沖洗3次（每次200μL）  

4. 檢測(cè)：  

  - 513nm測(cè)OD值（參考波長650nm）  

2.3 數(shù)據(jù)計(jì)算

標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合（示例）：

復(fù)制

濃度(μg)   OD513-OD650  

0           0.012  

5           0.328  

10          0.701  

→ 擬合方程：y=0.068x + 0.011 (R2=0.998)  

三、性能驗(yàn)證與問題排查

3.1 質(zhì)量控制指標(biāo)

合格標(biāo)準(zhǔn)：

? 空白孔OD值<0.05

? 標(biāo)準(zhǔn)曲線R2≥0.98

? 批內(nèi)CV<8%（n=3）

3.2 典型應(yīng)用數(shù)據(jù)

案例1：皮膚衰老研究

年輕vs年老小鼠真皮：

復(fù)制

年輕組：12.3±1.2 μg/mg組織  

年老組：6.8±0.9 μg/mg組織（p<0.01）  

案例2：藥物干預(yù)效果

TGF-β抑制劑處理組：

彈性蛋白合成增加 2.4倍（vs對(duì)照組）

3.3 故障診斷表

現(xiàn)象 可能原因 解決方案

標(biāo)準(zhǔn)曲線線性差 染色時(shí)間不足 延長反應(yīng)至45分鐘

樣本OD值超出范圍 未充分提取 增加加熱時(shí)間至3小時(shí)

背景值過高 增加至5次洗滌

四、技術(shù)問答（Q&A）

Q1：能否檢測(cè)彈性蛋白降解產(chǎn)物？

可檢測(cè) α-彈性蛋白（使用F2000-A提取），但需注意 elastin peptides 需專用抗體檢測(cè)

Q2：與Masson染色相關(guān)性？

比色法結(jié)果與 Verhoeff染色 陽性面積顯著相關(guān)（r=0.89, p<0.001），但與Masson染色無直接可比性

文檔優(yōu)化建議：

插入 【標(biāo)準(zhǔn)曲線示例圖】（含95%置信區(qū)間）

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關(guān)鍵步驟標(biāo)注 ??注意（如"避免使用金屬器械"）