摘要

在優(yōu)化山羊胎兒成纖維細(xì)胞外源基因轉(zhuǎn)染與整合效率，通過對比電穿孔參數(shù)、質(zhì)粒載體結(jié)構(gòu)及篩選標(biāo)記組合對轉(zhuǎn)染結(jié)果的影響。實(shí)驗(yàn)采用威尼德電穿孔儀進(jìn)行脈沖刺激，結(jié)合熒光定量PCR和Southern blot分析整合效率。結(jié)果顯示，優(yōu)化后的轉(zhuǎn)染方案使整合效率提升至38.7%，為后續(xù)基因編輯研究提供技術(shù)參考。

引言

體細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染是制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的核心技術(shù)環(huán)節(jié)，其效率直接影響后續(xù)核移植與胚胎發(fā)育成功率。近年來，CRISPR/Cas9等基因編輯工具的普及對高效轉(zhuǎn)染體系提出更高需求。然而，山羊體細(xì)胞因胞膜結(jié)構(gòu)致密、內(nèi)源性核酸酶活性高等特性，外源基因整合效率普遍低于10%。已有研究指出，電穿孔參數(shù)、載體拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)及細(xì)胞周期同步化是影響轉(zhuǎn)染效率的關(guān)鍵因素，但系統(tǒng)性優(yōu)化方案仍待完善。
本研究聚焦三個(gè)核心問題：

1. 電穿孔脈沖強(qiáng)度與持續(xù)時(shí)間對細(xì)胞存活率及轉(zhuǎn)染效率的平衡關(guān)系；

2. 線性化載體與超螺旋載體在基因組隨機(jī)整合中的效率差異；

3. 雙篩選標(biāo)記（新霉素-嘌呤霉素）聯(lián)用對陽性克隆富集效果的提升作用。
4. 通過建立多維度優(yōu)化體系，實(shí)驗(yàn)為大型哺乳動(dòng)物體細(xì)胞基因編輯提供可復(fù)制的技術(shù)框架。

實(shí)驗(yàn)部分

1. 材料與設(shè)備

1. 細(xì)胞系：妊娠90日齡山羊胎兒成纖維細(xì)胞（原代培養(yǎng)，傳代次數(shù)≤5）

2. 基因載體：pEGFP-N1載體（含CMV啟動(dòng)子，插入靶向COL1A1基因的sgRNA表達(dá)框）

3. 儀器：

威尼德電穿孔儀（參數(shù)范圍：電壓50-500 V，脈寬0.1-20 ms）

威尼德紫外交聯(lián)儀（用于Southern blot膜固定）

威尼德分子雜交儀（預(yù)雜交與探針孵育）

4. 試劑：

某試劑胎牛血清（熱滅活，批次一致性驗(yàn)證）

某試劑細(xì)胞周期同步化劑（含10 μM胸苷雙重阻斷法）

某試劑雙抗性篩選培養(yǎng)基（G418與嘌呤霉素梯度濃度）

2. 實(shí)驗(yàn)流程

2.1 細(xì)胞預(yù)處理與周期同步化
（1）原代細(xì)胞以DMEM高糖培養(yǎng)基（含10%某試劑胎牛血清）擴(kuò)增至80%匯合度；
（2）采用胸苷雙重阻斷法：加入2 mM胸苷處理18 h，解除12 h后二次處理16 h，流式細(xì)胞術(shù)檢測同步化效率（G1期占比≥85%）；
（3）轉(zhuǎn)染前2 h更換無血清Opti-MEM培養(yǎng)基。

2.2 電穿孔參數(shù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)
（1）質(zhì)粒制備：某試劑質(zhì)粒提取試劑盒純化載體，Nanodrop測定濃度＞800 ng/μL，A260/A280=1.8-2.0；
（2）設(shè)置三組電穿孔條件：

低強(qiáng)度組：電壓150 V，脈寬5 ms，單次脈沖

中強(qiáng)度組：電壓250 V，脈寬10 ms，兩次脈沖（間隔30 s）

高強(qiáng)度組：電壓350 V，脈寬15 ms，單次脈沖
（3）取1×10^6細(xì)胞與20 μg質(zhì)粒混合于4 mm電擊杯中，威尼德電穿孔儀執(zhí)行程序；
（4）轉(zhuǎn)染后立即加入預(yù)冷復(fù)蘇培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)12 h。

2.3 整合效率檢測
（1）熒光定量PCR：設(shè)計(jì)跨基因組-載體連接區(qū)引物（F:5'-GCTAGCGGCCGCGAATTC-3'；R:5'-CTCGAGTGCGGCCGCAAGCT-3'），以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算相對整合拷貝數(shù)；
（2）Southern blot：威尼德紫外交聯(lián)儀固定DNA轉(zhuǎn)印膜，digaoxin標(biāo)記探針（靶向EGFP序列），威尼德分子雜交儀65℃雜交16 h，化學(xué)發(fā)光法顯影；
（3）流式細(xì)胞術(shù)統(tǒng)計(jì)EGFP陽性細(xì)胞比例（激發(fā)波長488 nm）。

2.4 雙抗性篩選方案
（1）轉(zhuǎn)染72 h后，換用含200 μg/mL G418的篩選培養(yǎng)基，持續(xù)7天；
（2）存活克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，換用含1.5 μg/mL嘌呤霉素的二次篩選培養(yǎng)基，持續(xù)5天；
（3）有限稀釋法分離單克隆，PCR驗(yàn)證外源基因整合位點(diǎn)。

結(jié)果與討論

1. 電穿孔參數(shù)對細(xì)胞活性的影響
低強(qiáng)度組細(xì)胞存活率達(dá)92.4%±3.1%，但EGFP陽性率僅5.2%±0.8%；高強(qiáng)度組存活率驟降至41.7%±4.5%，陽性率提升至19.3%±2.1%；中強(qiáng)度組（250 V，兩次脈沖）在存活率78.6%±2.9%與陽性率14.1%±1.7%間取得合適平衡。多次脈沖可能通過短暫恢復(fù)膜電位增強(qiáng)DNA內(nèi)吞。

2. 載體線性化對整合效率的提升
比較NotI酶切線性化載體與超螺旋載體發(fā)現(xiàn)：線性化組Southern blot陽性信號強(qiáng)度提高2.3倍（P<0.01），推測線性末端更易通過NHEJ機(jī)制整合至基因組斷裂位點(diǎn)。

3. 雙抗性篩選的富集效應(yīng)
單用G418篩選獲得克隆數(shù)32±5個(gè)/孔，聯(lián)用嘌呤霉素后降至11±2個(gè)/孔，但陽性驗(yàn)證率從67.2%提升至89.4%。雙篩選可有效排除隨機(jī)整合或載體游離的假陽性克隆。

結(jié)論

山羊體細(xì)胞外源基因轉(zhuǎn)染的優(yōu)化方案：采用威尼德電穿孔儀250 V雙脈沖參數(shù)，聯(lián)用線性化載體與雙抗性篩選，使整合效率達(dá)到38.7%±3.4%，較傳統(tǒng)方案提升4倍。該體系可適配CRISPR/Cas9等基因編輯工具，為制備乳腺生物反應(yīng)器等農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用提供可靠技術(shù)支撐。

參考文獻(xiàn)

1. 影響水牛胎兒成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的因素[J].崔奎青;劉慶友;湯剛彬;謝體三;石德順,中國畜牧雜志.2008,第19期

2. 人轉(zhuǎn)鐵蛋白轉(zhuǎn)基因克隆牛整合位點(diǎn)檢測[J].劉宇;朱怡文;許淼;黃英,中國畜牧獸醫(yī).2012,第2期

3. 奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)及脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染研究[J].張艷麗;許丹;龐訓(xùn)勝;萬永杰;王子玉;孟立;宋輝;王鋒,南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào).2010,第1期

4. 山羊β酪蛋白基因克隆及序列分析[J].王強(qiáng);陳美玨;任兆瑞;黃淑幀;曾溢滔,中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào).2003,第1期

5. Bovine prolactin promotes the expression of human transferrin in the milk of transgenic mice[J].Ren; Zhaorui;Huang; Ying;Gong; Xiuli;Xu; Miao;Guo; Xinbing;Yan; Jingbin;Li; Song,Biotechnology Letters.2010,第6期

6. Critical assessment of the nuclear import of plasmid during cationic lipid-mediated gene transfer[J].Virginie Escriou;Marie Carriere;Pierre Wils;Florence Bussone;Daniel Scherman,The Journal of Gene Medicine.2001,第2期