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定向克隆構(gòu)建RAB5A真核表達載體研究

來源:威尼德生物科技(北京)有限公司   2025年05月10日 15:05  

摘要

研究通過分子克隆技術(shù)構(gòu)建RAB5A基因真核表達載體,并利用威尼德Gene Pulser 830方波型電穿孔儀實現(xiàn)高效轉(zhuǎn)染。實驗驗證了載體在HEK293T細胞中的表達效率及亞細胞定位特征,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染效率達85.3%,Western Blot檢測顯示RAB5A蛋白表達量較傳統(tǒng)方法提升42%。該體系為細胞內(nèi)吞機制研究提供了可靠工具,同時展示了新型電轉(zhuǎn)染設備在基因遞送中的技術(shù)優(yōu)勢。

引言

RAB5A作為調(diào)控早期內(nèi)吞體分選的關(guān)鍵GTP酶,其功能研究依賴高效的基因遞送系統(tǒng)。傳統(tǒng)磷酸鈣法和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染在難轉(zhuǎn)染細胞中效率不足,且易導致細胞毒性。方波電穿孔技術(shù)通過精準控制脈沖參數(shù),可突破細胞膜電荷屏障,尤其適用于大質(zhì)粒(>10 kb)的遞送。本研究通過定向克隆構(gòu)建pEGFP-RAB5A融合表達載體,結(jié)合威尼德Gene Pulser 830的智能阻抗檢測與預編程系統(tǒng),建立了標準化的轉(zhuǎn)染流程。

材料與方法

1. 載體構(gòu)建

采用Gibson Assembly定向克隆策略:

以人源cDNA文庫為模板,使用高保真某試劑品牌DNA聚合酶擴增RAB5A ORF(609 bp)

通過XhoI/EcoRI雙酶切將片段插入pEGFP-C1骨架載體

轉(zhuǎn)化某試劑品牌感受態(tài)細胞后,挑取單克隆進行Sanger測序驗證

2. 細胞轉(zhuǎn)染

HEK293T細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的某品牌DMEM培養(yǎng)基,密度達90%時進行電轉(zhuǎn):

使用威尼德Gene Pulser 830方波型電穿孔儀,選擇預設"Mammalian Cells > HEK293T"程序

將5 μg質(zhì)粒DNA與2×10^6細胞混合于4 mm電擊杯中

設備自動檢測樣品電阻并調(diào)整參數(shù),執(zhí)行單次脈沖

3. 檢測分析

轉(zhuǎn)染后48 h收獲細胞,某試劑品牌熒光顯微鏡觀察EGFP表達

ImageJ統(tǒng)計轉(zhuǎn)染效率(熒光陽性細胞占比)

某品牌RIPA裂解液提取總蛋白,Western Blot檢測RAB5A表達(一抗1:1000,二抗1:5000)

共聚焦顯微鏡觀察EGFP-RAB5A與早期內(nèi)吞體標志物EEA1的共定位

結(jié)果

1. 載體驗證

測序結(jié)果顯示克隆位點無移碼突變,酶切鑒定獲得預期609 bp插入片段。

2. 轉(zhuǎn)染效率

熒光顯微成像顯示EGFP陽性細胞呈均勻分布,威尼德系統(tǒng)轉(zhuǎn)染效率達85.3±2.1%,顯著高于常規(guī)脂質(zhì)體法的60.2±3.4%(p<0.01)。

3. 蛋白表達

Western Blot在55 kDa處檢測到特異性條帶,灰度分析顯示蛋白表達量較對照組提升42%。

4. 亞細胞定位

共聚焦圖像顯示EGFP-RAB5A與EEA1熒光信號重疊率>90%,符合其在內(nèi)吞體膜定位特征。

討論

研究成功的關(guān)鍵在于電轉(zhuǎn)參數(shù)的精準控制:

1. 方波脈沖技術(shù)優(yōu)勢

威尼德Gene Pulser 830的高強度方波脈沖可在毫秒級時間內(nèi)可逆性改變細胞膜通透性,其極性反轉(zhuǎn)功能有效克服HEK293T細胞的膜電荷屏障。相較于傳統(tǒng)指數(shù)波,方波對細胞活性的影響降低37%(臺盼藍檢測數(shù)據(jù))。

2. 智能化實驗流程

設備預置的HEK293T轉(zhuǎn)染參數(shù)(經(jīng)500+實驗室驗證)確保了實驗重復性。智能阻抗檢測模塊實時監(jiān)測細胞懸液狀態(tài),動態(tài)調(diào)整脈沖強度,使不同批次實驗的CV值控制在5%以內(nèi)。

3. 安全與擴展性

電弧防護系統(tǒng)避免DNA降解,模塊化設計支持后續(xù)活體電轉(zhuǎn)實驗拓展。腳踏開關(guān)操作顯著提升高通量實驗效率,單日可完成20組以上轉(zhuǎn)染樣本。

結(jié)論

研究建立的RAB5A真核表達系統(tǒng)為細胞內(nèi)吞研究提供可靠工具。威尼德Gene Pulser 830方波型電穿孔儀憑借其智能化參數(shù)調(diào)控與高效遞送能力,在CRISPR編輯、病毒包裝等領(lǐng)域展現(xiàn)出顯著技術(shù)優(yōu)勢。其全波形監(jiān)控與數(shù)據(jù)追溯功能為科研質(zhì)量管控提供了創(chuàng)新解決方案。

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