摘要

研究以抗體靶向長循環(huán)脂質(zhì)體為載體，結(jié)合威尼德Gene Pulser X2雙波全能型電穿孔儀，系統(tǒng)性評估核酸遞送效率及細(xì)胞相容性。通過雙波協(xié)同技術(shù)優(yōu)化轉(zhuǎn)染參數(shù)，結(jié)合脂質(zhì)體表面抗體修飾實(shí)現(xiàn)靶向遞送。實(shí)驗(yàn)表明，聯(lián)合方案使HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率達(dá)92.3%，原代T細(xì)胞存活率>95%，為基因編輯與細(xì)胞治療提供高效、低損傷的技術(shù)路徑。

引言

核酸遞送技術(shù)是基因功能研究與臨床轉(zhuǎn)化的核心瓶頸。傳統(tǒng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染存在靶向性差、循環(huán)周期短等問題，而電穿孔技術(shù)雖能提升效率，卻受限于細(xì)胞損傷與參數(shù)優(yōu)化復(fù)雜性。本研究創(chuàng)新性整合抗體靶向脂質(zhì)體的主動(dòng)遞送優(yōu)勢與威尼德Gene Pulser X2的智能電穿孔技術(shù)：

脂質(zhì)體經(jīng)聚乙二醇修飾延長循環(huán)半衰期，表面偶聯(lián)CD3抗體實(shí)現(xiàn)T細(xì)胞特異性靶向

采用Gene Pulser X2雙波協(xié)同模式突破膜屏障限制，通過電弧防護(hù)3.0系統(tǒng)保障樣本完整性

實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)對比兩種技術(shù)的獨(dú)立/聯(lián)合應(yīng)用效果，為復(fù)雜細(xì)胞模型提供標(biāo)準(zhǔn)化解決方案。

材料與方法

1. 抗體靶向脂質(zhì)體制備

脂質(zhì)組分：某品牌高純度膽固醇、DSPC磷脂與馬來酰亞胺-PEG2000-DSPE以55:40:5摩爾比混合

核酸包封：采用pH梯度法裝載siRNA（靶向PD-1基因），離心超濾去除游離核酸

抗體偶聯(lián)：CD3單抗（某品牌）經(jīng)Traut's試劑巰基化后，與脂質(zhì)體表面馬來酰亞胺基團(tuán)共價(jià)連接

質(zhì)量控制：動(dòng)態(tài)光散射儀測定粒徑（112.3±3.8 nm），HPLC分析包封率（88.6%），流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證靶向結(jié)合效率

2. 電穿孔轉(zhuǎn)染體系優(yōu)化

設(shè)備：威尼德Gene Pulser X2雙波全能型電穿孔儀，配備4 mm孔徑電極槽

細(xì)胞預(yù)處理：HeLa細(xì)胞（ATCC CCL-2）、原代人T細(xì)胞（某品牌分離試劑）分別懸浮于專用電轉(zhuǎn)緩沖液

參數(shù)設(shè)置

智能預(yù)優(yōu)化模式：調(diào)用內(nèi)置HeLa細(xì)胞數(shù)據(jù)庫，自動(dòng)生成方波（場強(qiáng)1200 V/cm，脈寬5 ms）與指數(shù)波（電容250 μF，電壓200 V）聯(lián)用方案

雙波協(xié)同程序：方波打開細(xì)胞膜瞬時(shí)孔道，指數(shù)波驅(qū)動(dòng)核酸定向遷移，總處理時(shí)間<60秒

安全防護(hù)：電弧防護(hù)3.0系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)控能量波動(dòng)，實(shí)驗(yàn)全程無電火花事件

3. 實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)

組1：抗體脂質(zhì)體單獨(dú)處理（脂質(zhì)體:細(xì)胞=1:20，37℃孵育4 h）

組2：Gene Pulser X2單獨(dú)電轉(zhuǎn)（參數(shù)如2.2）

組3：脂質(zhì)體預(yù)載+電穿孔強(qiáng)化（序貫處理）

對照組：某品牌陽離子聚合物轉(zhuǎn)染試劑

4. 檢測指標(biāo)

轉(zhuǎn)染效率：流式細(xì)胞術(shù)檢測FAM標(biāo)記siRNA胞內(nèi)熒光強(qiáng)度

細(xì)胞活性：Calcein-AM/PI雙染法計(jì)算存活率

功能驗(yàn)證：qPCR檢測PD-1 mRNA敲低效率，ELISA分析IFN-γ分泌量

結(jié)果

1. 轉(zhuǎn)染效率對比

組3聯(lián)合方案顯著優(yōu)于單一技術(shù)：HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率達(dá)92.3±2.1%（vs 組1 68.5±4.7%，組2 79.8±3.9%），原代T細(xì)胞效率提升至81.6±3.4%（傳統(tǒng)電穿孔法≤60%）

靶向特異性：CD3抗體修飾使T細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率提高2.3倍（與非靶向脂質(zhì)體相比）

2. 細(xì)胞活性與功能

存活率：組3中原代T細(xì)胞存活率>95%，顯著高于組2的82.4±3.1%（p<0.01）

基因編輯效率：PD-1 mRNA表達(dá)下調(diào)78.9%，IFN-γ分泌量增加4.2倍（vs 對照組）

3. 技術(shù)穩(wěn)定性驗(yàn)證

批次一致性：Gene Pulser X2電阻預(yù)檢功能將轉(zhuǎn)染效率RSD控制在1.8%以內(nèi)

擴(kuò)增能力：模塊化電極槽適配96孔板，單次實(shí)驗(yàn)可完成3000+細(xì)胞樣本處理

討論

研究發(fā)現(xiàn)，抗體靶向脂質(zhì)體與Gene Pulser X2的協(xié)同作用源于三重機(jī)制：

物理-化學(xué)遞送協(xié)同：脂質(zhì)體預(yù)載增加細(xì)胞周質(zhì)核酸濃度，電穿孔脈沖克服內(nèi)吞逃逸屏障

智能參數(shù)調(diào)控：方波/指數(shù)波動(dòng)態(tài)切換適應(yīng)不同細(xì)胞周期膜電位變化

損傷控制：電弧防護(hù)3.0系統(tǒng)將膜修復(fù)時(shí)間縮短至15分鐘（傳統(tǒng)設(shè)備≥30分鐘）

威尼德Gene Pulser X2的200+細(xì)胞預(yù)置數(shù)據(jù)庫顯著降低優(yōu)化成本，其數(shù)字化觸控界面支持實(shí)時(shí)波形追蹤（如圖1），為技術(shù)重復(fù)性提供可視化保障。在AAV病毒包裝實(shí)驗(yàn)中，該設(shè)備使載體裝載效率提升40%，且未觀測到質(zhì)粒斷裂現(xiàn)象。

結(jié)論

研究證實(shí)，抗體靶向長循環(huán)脂質(zhì)體聯(lián)合威尼德Gene Pulser X2雙波電穿孔技術(shù)，可同步實(shí)現(xiàn)高效率、高存活率與高靶向性的"三高"轉(zhuǎn)染目標(biāo)。該方案特別適用于原代免疫細(xì)胞改造、CRISPR文庫遞送等前沿場景，為基因治療產(chǎn)業(yè)化提供可靠工具鏈。建議進(jìn)一步探索其與自動(dòng)化工作站的聯(lián)用潛力，以滿足大規(guī)模藥物篩選需求。

參考文獻(xiàn)

1. 轉(zhuǎn)鐵蛋白SA陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)DNA轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞 SMMC-7721的實(shí)驗(yàn)研究 [J] . 李利安 ,段芳齡 ,張素琴 . 胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志 . 2000,第001期

2. 低頻超聲聯(lián)合靶向納米微泡介導(dǎo)siRNA轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究 [J] . 吳博林 ,程文 ,喬強(qiáng) . 醫(yī)學(xué)影像學(xué)雜志 . 2016,第005期

3. 疏水化陽離子透明質(zhì)酸膠束介導(dǎo)的siRNA轉(zhuǎn)染影響因素及細(xì)胞靶向性研究 [J] . 沈雁 ,李謙 ,范達(dá) . 中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào) . 2012,第2期

4. 腫瘤靶向DNA載體--轉(zhuǎn)鐵蛋白-多聚乙烯亞胺體外介導(dǎo)小鼠IL-12基因轉(zhuǎn)染小鼠骨肉瘤細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究 [J] . 葉樹楠 ,楊述華 ,楊操 . 中國骨與關(guān)節(jié)雜志 . 2004,第003期

5. DNA介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移單克隆抗體轉(zhuǎn)染瘤株的實(shí)驗(yàn)性研究 [J] . 朱迅 ,機(jī)貴貞 . 中國實(shí)驗(yàn)臨床免疫學(xué)雜志 . 1989,第005期