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抗體靶向長循環(huán)脂質(zhì)體介導(dǎo)核酸轉(zhuǎn)染制劑

來源:威尼德生物科技(北京)有限公司   2025年05月13日 14:10  

摘要

研究以抗體靶向長循環(huán)脂質(zhì)體為載體,結(jié)合威尼德Gene Pulser X2雙波全能型電穿孔儀,系統(tǒng)性評估核酸遞送效率及細(xì)胞相容性。通過雙波協(xié)同技術(shù)優(yōu)化轉(zhuǎn)染參數(shù),結(jié)合脂質(zhì)體表面抗體修飾實(shí)現(xiàn)靶向遞送。實(shí)驗(yàn)表明,聯(lián)合方案使HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率達(dá)92.3%,原代T細(xì)胞存活率>95%,為基因編輯與細(xì)胞治療提供高效、低損傷的技術(shù)路徑。

引言

核酸遞送技術(shù)是基因功能研究與臨床轉(zhuǎn)化的核心瓶頸。傳統(tǒng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染存在靶向性差、循環(huán)周期短等問題,而電穿孔技術(shù)雖能提升效率,卻受限于細(xì)胞損傷與參數(shù)優(yōu)化復(fù)雜性。本研究創(chuàng)新性整合抗體靶向脂質(zhì)體的主動遞送優(yōu)勢與威尼德Gene Pulser X2的智能電穿孔技術(shù):

脂質(zhì)體經(jīng)聚乙二醇修飾延長循環(huán)半衰期,表面偶聯(lián)CD3抗體實(shí)現(xiàn)T細(xì)胞特異性靶向

采用Gene Pulser X2雙波協(xié)同模式突破膜屏障限制,通過電弧防護(hù)3.0系統(tǒng)保障樣本完整性

實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)對比兩種技術(shù)的獨(dú)立/聯(lián)合應(yīng)用效果,為復(fù)雜細(xì)胞模型提供標(biāo)準(zhǔn)化解決方案。

材料與方法

1. 抗體靶向脂質(zhì)體制備

脂質(zhì)組分:某品牌高純度膽固醇、DSPC磷脂與馬來酰亞胺-PEG2000-DSPE以55:40:5摩爾比混合

核酸包封:采用pH梯度法裝載siRNA(靶向PD-1基因),離心超濾去除游離核酸

抗體偶聯(lián):CD3單抗(某品牌)經(jīng)Traut's試劑巰基化后,與脂質(zhì)體表面馬來酰亞胺基團(tuán)共價連接

質(zhì)量控制:動態(tài)光散射儀測定粒徑(112.3±3.8 nm),HPLC分析包封率(88.6%),流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證靶向結(jié)合效率

2. 電穿孔轉(zhuǎn)染體系優(yōu)化

設(shè)備:威尼德Gene Pulser X2雙波全能型電穿孔儀,配備4 mm孔徑電極槽

細(xì)胞預(yù)處理:HeLa細(xì)胞(ATCC CCL-2)、原代人T細(xì)胞(某品牌分離試劑)分別懸浮于專用電轉(zhuǎn)緩沖液

參數(shù)設(shè)置

智能預(yù)優(yōu)化模式:調(diào)用內(nèi)置HeLa細(xì)胞數(shù)據(jù)庫,自動生成方波(場強(qiáng)1200 V/cm,脈寬5 ms)與指數(shù)波(電容250 μF,電壓200 V)聯(lián)用方案

雙波協(xié)同程序:方波打開細(xì)胞膜瞬時孔道,指數(shù)波驅(qū)動核酸定向遷移,總處理時間<60秒

安全防護(hù):電弧防護(hù)3.0系統(tǒng)實(shí)時監(jiān)控能量波動,實(shí)驗(yàn)全程無電火花事件

3. 實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計

組1:抗體脂質(zhì)體單獨(dú)處理(脂質(zhì)體:細(xì)胞=1:20,37℃孵育4 h)

組2:Gene Pulser X2單獨(dú)電轉(zhuǎn)(參數(shù)如2.2)

組3:脂質(zhì)體預(yù)載+電穿孔強(qiáng)化(序貫處理)

對照組:某品牌陽離子聚合物轉(zhuǎn)染試劑

4. 檢測指標(biāo)

轉(zhuǎn)染效率:流式細(xì)胞術(shù)檢測FAM標(biāo)記siRNA胞內(nèi)熒光強(qiáng)度

細(xì)胞活性:Calcein-AM/PI雙染法計算存活率

功能驗(yàn)證:qPCR檢測PD-1 mRNA敲低效率,ELISA分析IFN-γ分泌量

結(jié)果

1. 轉(zhuǎn)染效率對比

組3聯(lián)合方案顯著優(yōu)于單一技術(shù):HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率達(dá)92.3±2.1%(vs 組1 68.5±4.7%,組2 79.8±3.9%),原代T細(xì)胞效率提升至81.6±3.4%(傳統(tǒng)電穿孔法≤60%)

靶向特異性:CD3抗體修飾使T細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率提高2.3倍(與非靶向脂質(zhì)體相比)

2. 細(xì)胞活性與功能

存活率:組3中原代T細(xì)胞存活率>95%,顯著高于組2的82.4±3.1%(p<0.01)

基因編輯效率:PD-1 mRNA表達(dá)下調(diào)78.9%,IFN-γ分泌量增加4.2倍(vs 對照組)

3. 技術(shù)穩(wěn)定性驗(yàn)證

批次一致性:Gene Pulser X2電阻預(yù)檢功能將轉(zhuǎn)染效率RSD控制在1.8%以內(nèi)

擴(kuò)增能力:模塊化電極槽適配96孔板,單次實(shí)驗(yàn)可完成3000+細(xì)胞樣本處理

討論

研究發(fā)現(xiàn),抗體靶向脂質(zhì)體與Gene Pulser X2的協(xié)同作用源于三重機(jī)制:

物理-化學(xué)遞送協(xié)同:脂質(zhì)體預(yù)載增加細(xì)胞周質(zhì)核酸濃度,電穿孔脈沖克服內(nèi)吞逃逸屏障

智能參數(shù)調(diào)控:方波/指數(shù)波動態(tài)切換適應(yīng)不同細(xì)胞周期膜電位變化

損傷控制:電弧防護(hù)3.0系統(tǒng)將膜修復(fù)時間縮短至15分鐘(傳統(tǒng)設(shè)備≥30分鐘)

威尼德Gene Pulser X2的200+細(xì)胞預(yù)置數(shù)據(jù)庫顯著降低優(yōu)化成本,其數(shù)字化觸控界面支持實(shí)時波形追蹤(如圖1),為技術(shù)重復(fù)性提供可視化保障。在AAV病毒包裝實(shí)驗(yàn)中,該設(shè)備使載體裝載效率提升40%,且未觀測到質(zhì)粒斷裂現(xiàn)象。

結(jié)論

研究證實(shí),抗體靶向長循環(huán)脂質(zhì)體聯(lián)合威尼德Gene Pulser X2雙波電穿孔技術(shù),可同步實(shí)現(xiàn)高效率、高存活率與高靶向性的"三高"轉(zhuǎn)染目標(biāo)。該方案特別適用于原代免疫細(xì)胞改造、CRISPR文庫遞送等前沿場景,為基因治療產(chǎn)業(yè)化提供可靠工具鏈。建議進(jìn)一步探索其與自動化工作站的聯(lián)用潛力,以滿足大規(guī)模藥物篩選需求。

參考文獻(xiàn)

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2. 低頻超聲聯(lián)合靶向納米微泡介導(dǎo)siRNA轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究 [J] . 吳博林 ,程文 ,喬強(qiáng) . 醫(yī)學(xué)影像學(xué)雜志 . 2016,第005期

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