摘要

豬圓環(huán)病毒 2 型（PCV2）是危害養(yǎng)豬業(yè)的重要病原，精準(zhǔn)檢測(cè)其在組織中的分布是疫病防控關(guān)鍵。本研究基于威尼德 HB-500 原位雜交儀，構(gòu)建 PCV2 特異性熒光原位雜交（FISH）檢測(cè)技術(shù)。通過(guò)設(shè)計(jì)靶向 ORF2 基因探針并優(yōu)化雜交條件，實(shí)現(xiàn) PCV2 在豬腎細(xì)胞及組織樣本中的單細(xì)胞水平定位，為 PCV2 致病機(jī)制研究與臨床快速診斷提供高效技術(shù)平臺(tái)。

一、引言

豬圓環(huán)病毒 2 型（Porcine circovirus type 2, PCV2）是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）、豬皮炎腎病綜合征（PDNS）等疾病的主要病原體，嚴(yán)重威脅全球養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展。該病毒具有感染隱蔽性強(qiáng)、免疫逃逸能力突出等特點(diǎn)，傳統(tǒng)檢測(cè)方法如 PCR 雖能定量病毒核酸，但無(wú)法直觀呈現(xiàn)病毒在組織細(xì)胞中的時(shí)空分布；免疫組化技術(shù)依賴抗體特異性，易受交叉反應(yīng)干擾，且難以實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞層面的精準(zhǔn)定位。

熒光原位雜交技術(shù)（Fluorescence in situ hybridization, FISH）通過(guò)熒光標(biāo)記的 DNA 探針與靶病毒核酸序列特異性結(jié)合，可在組織切片或細(xì)胞樣本中直接觀察病毒分布，兼具高特異性與可視化優(yōu)勢(shì)。該技術(shù)不僅能準(zhǔn)確識(shí)別 PCV2 感染的靶細(xì)胞類型，還可分析病毒在宿主組織中的定植模式，為解析 PCV2 致病機(jī)制、評(píng)估疫苗免疫效果提供關(guān)鍵細(xì)胞學(xué)證據(jù)。

威尼德 HB-500 原位雜交儀作為分子病理檢測(cè)的核心設(shè)備，為 PCV2 的 FISH 檢測(cè)提供了精準(zhǔn)可控的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。其搭載的模糊 PID 智能算法與熱蓋控溫技術(shù)，實(shí)現(xiàn) 12 張玻片全域溫差≤±1℃，確保雜交過(guò)程中溫度均一性，避免因溫度波動(dòng)導(dǎo)致的探針非特異性結(jié)合；全密封濕度控制系統(tǒng)維持≥90% RH 恒濕環(huán)境，有效防止雜交液揮發(fā)，顯著提升探針與病毒核酸的結(jié)合效率。儀器支持全自動(dòng)變性 - 雜交一體化流程，配合 7 英寸智能觸控屏與 110 組用戶程序預(yù)設(shè)功能，可大幅簡(jiǎn)化操作步驟、縮短實(shí)驗(yàn)周期，為 PCV2 的高通量檢測(cè)與大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查提供技術(shù)保障。本研究旨在建立基于威尼德 HB-500 原位雜交儀的 PCV2 原位雜交檢測(cè)方法，驗(yàn)證其在獸醫(yī)病理學(xué)與臨床診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

二、材料與方法

（一）實(shí)驗(yàn)材料

1. 1. 生物樣本：

• 病毒株：PCV2 分離株（基因型為 PCV2d），由某獸醫(yī)研究所提供，接種于 PK-15 豬腎細(xì)胞進(jìn)行增殖培養(yǎng)，收集感染 72 h 的細(xì)胞樣本（用于細(xì)胞水平檢測(cè)）。

• 組織樣本：人工感染 PCV2 的 SPF 仔豬腎臟、淋巴結(jié)組織（經(jīng)病理切片驗(yàn)證為典型 PCV2 感染病變），以及健康仔豬對(duì)應(yīng)組織作為陰性對(duì)照，樣本經(jīng) 4% 多聚甲醛固定、石蠟包埋備用。

2. 2. 探針設(shè)計(jì)與制備：

• 靶序列選擇 PCV2 基因組中高度保守的 ORF2 基因區(qū)域（核苷酸位置 500-700 bp），設(shè)計(jì)特異性 DNA 探針（長(zhǎng)度 50 bp），5' 端標(biāo)記 FITC 熒光素（綠色熒光，激發(fā)波長(zhǎng) 488 nm），由某生物科技公司合成并純化。

• 內(nèi)參探針：豬 β-actin 基因探針（標(biāo)記為 Cy3 熒光素，紅色熒光，激發(fā)波長(zhǎng) 570 nm），用于細(xì)胞定位與背景信號(hào)校準(zhǔn)。

（二）主要試劑

實(shí)驗(yàn)所用試劑包括某試劑（用于細(xì)胞固定、探針稀釋及雜交緩沖液配制）、4% 多聚甲醛（pH 7.2）、1×PBS 緩沖液、20×SSC（含 3 M NaCl，0.3 M 檸檬酸鈉，pH 7.0）、甲酰胺、硫酸葡聚糖、鮭魚精 DNA、DAPI 復(fù)染劑（1 μg/mL）、抗熒光淬滅封片劑等，均為分析純級(jí)別。

（三）主要儀器

威尼德 HB-500 原位雜交儀（具備精準(zhǔn)控溫、全自動(dòng)變性 - 雜交功能，支持 12 張玻片并行處理）、熒光顯微鏡（配備 UV、綠光、紅光激發(fā)模塊）、石蠟切片機(jī)、恒溫振蕩水浴鍋、高速冷凍離心機(jī)、顯微操作儀、移液器等。

（四）實(shí)驗(yàn)方法

1. 樣本預(yù)處理

• 1. 細(xì)胞樣本制備：收集 PCV2 感染的 PK-15 細(xì)胞，用 4% 多聚甲醛固定 30 min，1×PBS 洗滌 3 次，制備細(xì)胞爬片；健康 PK-15 細(xì)胞作為陰性對(duì)照。

• 2. 組織樣本處理：石蠟包埋組織塊切成 5 μm 薄片，依次經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，置于 1×PBS 中待用；組織切片經(jīng)胃蛋白酶溶液（10 μg/mL，37℃，10 min）消化以增強(qiáng)探針通透性，再次用梯度乙醇脫水，室溫晾干。

• 
  

2. 玻片預(yù)處理與變性

將細(xì)胞爬片或組織切片玻片放入威尼德 HB-500 原位雜交儀，70℃烘烤 2 h 增強(qiáng)樣本粘附力。隨后進(jìn)行預(yù)處理：2×SSC（37℃，15 min）洗滌去除雜質(zhì)，蛋白酶 K 溶液（20 μg/mL，37℃，8 min）消化蛋白質(zhì)，經(jīng) 70%、85%、100% 乙醇梯度脫水后晾干。

3. 探針混合與雜交程序

• 1. 雜交緩沖液配制：將 PCV2 ORF2 探針與 β-actin 探針分別以 1:100 比例溶于雜交緩沖液（含 50% 甲酰胺，10% 硫酸葡聚糖，2×SSC，100 μg/mL 鮭魚精 DNA），充分混勻后加入儀器探針槽。

• 2. 全自動(dòng)變性 - 雜交流程：?jiǎn)?dòng)威尼德 HB-500 原位雜交儀的 "病毒檢測(cè)專用程序"，首先對(duì)探針混合液在 95℃變性 10 min，立即冰浴 5 min；將變性探針均勻滴加于樣本玻片，覆蓋蓋玻片并密封。儀器自動(dòng)升溫至 42℃預(yù)雜交 1 h，隨后降至 37℃進(jìn)行過(guò)夜雜交（16-18 h）。過(guò)程中儀器實(shí)時(shí)監(jiān)控溫度（全域溫差≤±1℃）與濕度（≥90% RH），確保探針與病毒核酸高效結(jié)合。

4. 洗片與信號(hào)檢測(cè)

雜交結(jié)束后，依次用 2×SSC（37℃，5 min×2 次）、1×SSC（37℃，10 min）、0.5×SSC（37℃，10 min）洗片以去除未結(jié)合探針，蒸餾水漂洗后晾干。滴加 DAPI 復(fù)染劑室溫孵育 10 min，抗熒光淬滅封片劑封片。

在熒光顯微鏡下觀察，PCV2 ORF2 探針信號(hào)呈綠色熒光，β-actin 探針信號(hào)呈紅色熒光（標(biāo)記宿主細(xì)胞骨架），DAPI 復(fù)染細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光。每個(gè)樣本隨機(jī)選取 50 個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)熒光信號(hào)的細(xì)胞定位、強(qiáng)度及感染細(xì)胞比例。

三、結(jié)果與分析

（一）探針特異性驗(yàn)證

在健康 PK-15 細(xì)胞與健康仔豬組織切片中，僅檢測(cè)到紅色熒光信號(hào)（β-actin 標(biāo)記的宿主細(xì)胞），無(wú)綠色熒光信號(hào)；而在 PCV2 感染的 PK-15 細(xì)胞中，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見明顯綠色熒光顆粒，呈散在或聚集分布；感染仔豬腎臟腎小管上皮細(xì)胞、淋巴結(jié)巨噬細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核周邊均觀察到強(qiáng)綠色熒光信號(hào)，與 PCV2 在宿主細(xì)胞中的復(fù)制位點(diǎn)一致。結(jié)果表明，ORF2 探針能特異性識(shí)別 PCV2 核酸，無(wú)交叉反應(yīng)。

（二）PCV2 檢測(cè)靈敏度與定位分析

1. 1. 細(xì)胞水平檢測(cè)：在感染復(fù)數(shù)（MOI）為 0.1 的 PK-15 細(xì)胞中，可檢測(cè)到單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光信號(hào)，靈敏度達(dá) 103 拷貝 / 細(xì)胞；隨著感染時(shí)間延長(zhǎng)（24-72 h），熒光信號(hào)強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，且在多核巨細(xì)胞中呈現(xiàn)區(qū)域性聚集分布，提示 PCV2 在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制與組裝具有時(shí)空特異性。

2. 2. 組織原位定位：感染仔豬腎臟組織中，PCV2 信號(hào)主要定位于腎小管上皮細(xì)胞與腎間質(zhì)巨噬細(xì)胞，腎小球區(qū)域未見明顯信號(hào)；淋巴結(jié)組織中，熒光信號(hào)集中于皮質(zhì)區(qū)的淋巴細(xì)胞與竇組織細(xì)胞，髓質(zhì)區(qū)信號(hào)較弱。該分布模式與 PCV2 所致間質(zhì)性腎炎、淋巴結(jié)炎的病理?yè)p傷部位高度吻合，為解析病毒組織嗜性與致病機(jī)制提供了直觀證據(jù)。

（三）威尼德 HB-500 原位雜交儀性能評(píng)估

• 1. 控溫穩(wěn)定性：連續(xù) 72 h 監(jiān)測(cè)顯示，12 張玻片溫度波動(dòng)均≤±1℃，不同玻片間 PCV2 信號(hào)強(qiáng)度變異系數(shù)＜8%，顯著優(yōu)于傳統(tǒng)水浴鍋雜交（變異系數(shù)＞30%），避免了因局部溫度不均導(dǎo)致的假陰性結(jié)果。

• 2. 流程效率優(yōu)化：全自動(dòng)程序?qū)鹘y(tǒng)手動(dòng)操作所需的 28-32 h 縮短至 20-22 h，且 "開蓋即操作" 的玻片卡槽設(shè)計(jì)減少了人工干預(yù)步驟，降低了污染風(fēng)險(xiǎn)。儀器支持多批次樣本并行處理，單次可同時(shí)檢測(cè) 12 份樣本，大幅提升批量檢測(cè)效率。

• 3. 數(shù)據(jù)可追溯性：儀器實(shí)時(shí)記錄溫度曲線、雜交時(shí)間等關(guān)鍵參數(shù)并支持 Excel 格式導(dǎo)出，為實(shí)驗(yàn)重復(fù)性驗(yàn)證與質(zhì)量控制提供了量化依據(jù)。在 3 次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，相同樣本的熒光信號(hào)定位與強(qiáng)度一致性達(dá) 95% 以上，符合國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)對(duì)分子病理檢測(cè)的可溯性要求。

四、結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了基于威尼德 HB-500 原位雜交儀的豬圓環(huán)病毒 2 型原位雜交檢測(cè)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了 PCV2 在細(xì)胞與組織樣本中的精準(zhǔn)定位與可視化分析。該技術(shù)突破了傳統(tǒng)檢測(cè)方法的局限性，既能特異性識(shí)別病毒核酸，又能直觀呈現(xiàn)病毒在宿主中的感染路徑與細(xì)胞嗜性，為 PCV2 的致病機(jī)制研究、疫苗效果評(píng)價(jià)及臨床病理診斷提供了高效工具。

威尼德 HB-500 原位雜交儀憑借其精準(zhǔn)的溫度控制、高效的全自動(dòng)流程及智能的數(shù)據(jù)管理功能，顯著提升了 PCV2 原位雜交實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性與操作效率。無(wú)論是獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室的病原定位研究，還是規(guī)模化豬場(chǎng)的臨床樣本篩查，該儀器均能為科研人員與獸醫(yī)工作者提供高精度、可重復(fù)的檢測(cè)方案。

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