1．培養(yǎng)上清中TGF-β的激活 測(cè)定前必須使無血清培養(yǎng)上清中TGF-β激活。激活有熱激活和酸激活兩種方法，熱激活法是通過將標(biāo)本加熱至80℃5min而激活。酸激活法的步驟如下：
①在200uL無血清培養(yǎng)上清中加6mol／LHCl 1．5ul，使pH≤3．0，22℃孵育30rain；
②用30ul中緩沖液中和，調(diào)至pH7．0～7．4。若pH值不在此范圍，可加少量1：10稀釋的6mol／LHCl或中和緩沖液調(diào)整（中和緩沖液為6mol／LNaOH和1mol／LHEPES等量混合而成）；
③用于胸腺細(xì)胞增殖法測(cè)定前，標(biāo)本用RPMI-1640稀釋4倍。

2．在24孔培養(yǎng)板中加A549細(xì)胞1．7X105／孔，在*DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)18～24h，以形成A549細(xì)胞單層，用結(jié)合緩沖液（含0．1％BSA的磷酸鹽緩沖液）洗滌1次。

3．在培養(yǎng)板的前四排中，用結(jié)合緩沖液對(duì)重組或純化TGF-p進(jìn)行系列稀釋，濃度范圍為1—1 000pmol／L，每孔200gL，用于繪制TGF-p的標(biāo)準(zhǔn)曲線；后兩排中，加系列稀釋的酸激活待測(cè)上清，200uL/孔。

4．將培養(yǎng)板置于22℃振蕩2h，用冷結(jié)合緩沖液洗3次，每孔加200／uL 50pmol／L125I-TGF-β，22℃孵育2h。

5．同上洗2次后，加600~L解離緩沖液，22℃作用20min，使細(xì)胞解離。解離緩沖液的配方為：20mmol／LHEPES、2％TritonX-100和10％甘油。

6．從每孔取500uL，用r計(jì)數(shù)儀測(cè)定放射活性。

7．通過測(cè)定外標(biāo)記TGF-β過量時(shí)（10nmol／L）的細(xì)胞放射活性，估計(jì)非