埃德曼測(cè)序的原理

埃德曼降解法測(cè)序（Edman degradation sequencing）誕生于二十世紀(jì)五十年代，是由瑞典化學(xué)家 Pehr Edman 提出并不斷完善的一種經(jīng)典蛋白質(zhì) N 端序列分析技術(shù)。該方法利用苯異硫氰酸酯（PITC）在弱堿性環(huán)境下與肽鏈 N 端 α-氨基發(fā)生選擇性縮合，形成可溶于有機(jī)溶劑的苯硫代氨基甲酰（PTC）衍生物；隨后在酸性條件下促使衍生肽的第一殘基從肽鏈中環(huán)化并裂解生成可鑒定的雙環(huán)衍生物（ATZ-氨基酸），經(jīng)異構(gòu)化和質(zhì)譜或高效液相色譜分離即可確定該殘基的化學(xué)身份。循環(huán)往復(fù)，研究者便可逐步“剝洋蔥”式地讀取多肽的線性序列。由于化學(xué)反應(yīng)嚴(yán)格依賴游離 α-氨基，Edman 測(cè)序可在毫微摩爾量級(jí)的樣品上實(shí)現(xiàn)單殘基分辨率，回收率理論上可達(dá) 98 %/cycle。它尤其適用于定位成熟蛋白 N 端、驗(yàn)證翻譯后修飾是否遮蔽起始?xì)埢?、確認(rèn)免疫印跡條帶或 SDS-PAGE 純化條帶中的目標(biāo)蛋白身份。當(dāng)研究對(duì)象為 3 kDa—30 kDa 的純化肽段或膠內(nèi)蛋白，并且需要在不依賴數(shù)據(jù)庫的情況下獲取精確 N 端序列時(shí)，Edman 降解依舊是不可替代的“金標(biāo)準(zhǔn)”。

圖1. 埃德曼測(cè)序流程

埃德曼測(cè)序的優(yōu)勢(shì)

Edman 降解原理的核心在于化學(xué)專一性與循環(huán)效率。苯異硫氰酸酯對(duì)游離氨基具有jí gāo親核反應(yīng)活性，而對(duì)肽鏈側(cè)鏈幾乎無親和力，從而保證了反應(yīng)位點(diǎn)dú yī wú èr；PTC-肽在極性有機(jī)溶劑中的可溶性則避免了固液相交錯(cuò)帶來的擴(kuò)散壁壘；酸解生成的 ATZ-氨基酸因其雙環(huán)結(jié)構(gòu)具備穩(wěn)定并可 UV 檢測(cè)的共軛體系，使得每輪檢測(cè)既快速又靈敏。通過樣品的固相固定（PVDF 膜或玻璃纖維濾片）與全自動(dòng)循環(huán)反應(yīng)器相結(jié)合，現(xiàn)代儀器可在 1–2 h 內(nèi)完成 10–15 個(gè)氨基酸殘基的識(shí)別，極大提高了高通量驗(yàn)證需求的響應(yīng)速度。對(duì)藥物研究而言，Edman 測(cè)序經(jīng)常被用來確認(rèn)抗體輕鏈或重鏈的 N 端序列，以及重組蛋白藥物在上游表達(dá)或下游精制過程中是否發(fā)生 N 端部分截短；在疾病機(jī)制研究中，炎癥相關(guān)蛋白或信號(hào)肽的剪切位點(diǎn)可通過 Edman 精確定位，從而為靶向抑制劑設(shè)計(jì)提供直接坐標(biāo)。

埃德曼測(cè)序的不足

然而，Edman 測(cè)序也存在固有局限。首先，樣品必須具備游離且未被翻譯后修飾（PTM）遮蔽的 N 端 α-氨基；乙?；?、甲酰化或環(huán)化（如吡咯啉）都會(huì)阻斷 PITC 縮合反應(yīng)，導(dǎo)致循環(huán)無法啟動(dòng)。其次，含有多硫鍵、酸不穩(wěn)定修飾或罕見氨基酸（如賽果氨酸）時(shí)，酸解步驟可能引發(fā)副反應(yīng)并降低讀序正確率；羥脯氨酸等修飾殘基缺乏穩(wěn)定衍生體，也會(huì)增加鑒定難度。再次，由于每一循環(huán)存在約 1–2 % 的衍生和裂解損失，理論最大讀長(zhǎng)通常受限于 40–60 個(gè)殘基，遠(yuǎn)低于質(zhì)譜測(cè)序可同時(shí)解析上百殘基肽段的能力；若樣本是混合物或存在 N 端裂解微雜，Edman 更難在單次讀取中解析多序列重疊信號(hào)。再者，操作仍需依賴昂貴試劑與專門的自動(dòng)化儀器，其維護(hù)成本和單樣本分析費(fèi)用在中小規(guī)模實(shí)驗(yàn)中可能高于傳統(tǒng)質(zhì)譜。

百泰派克的解決辦法

針對(duì)上述短板，百泰派克通過多策略整合為 Edman 測(cè)序注入現(xiàn)代化活力。首先，在樣品準(zhǔn)備端引入選擇性脫保護(hù)和化學(xué)還原策略：通過 N-端脫乙?；富蛄u胺處理可在溫和條件下解屏蔽 α-氨基，并使用 DTT/TCEP 完整斷開二硫鍵，從根源上提高循環(huán)起始效率；對(duì)環(huán)化起始?xì)埢?，則采用酸或酶促開環(huán)后再衍生。其次，實(shí)驗(yàn)平臺(tái)配備超微量激光切割系統(tǒng)與納升級(jí)捕集柱，使從 SDS-PAGE 條帶到固相固定的轉(zhuǎn)移回收率提升 20 %以上，并顯著降低背景噪聲；對(duì)于難溶跨膜片段，團(tuán)隊(duì)使用疏水捕集劑與可逆表面活性劑相結(jié)合的方法，在維持蛋白完整性的同時(shí)兼顧衍生反應(yīng)通量。再次，百泰派克在循環(huán)檢測(cè)后端疊加高分辨 LC-MS 輔助驗(yàn)證：若衍生氨基酸 UV 峰分辨度不足，質(zhì)譜將二次確認(rèn)分子量與碎片指紋，最大限度避免殘基誤判。對(duì)于超出 50 殘基的需求，公司提供“Edman-MS 組合策略”——先用 Edman 精確讀取前端 10–15 個(gè)殘基確定起始位點(diǎn)，再利用高能 CID/HCD 分段質(zhì)譜對(duì)后續(xù)序列進(jìn)行覆蓋，使整體讀長(zhǎng)突破 100 殘基。最后，在數(shù)據(jù)層面，內(nèi)置的算法可自動(dòng)校準(zhǔn)循環(huán)效率衰減曲線、補(bǔ)償異構(gòu)氨基酸共洗脫信號(hào)，并輸出置信度評(píng)分，方便研究者一鍵集成到 LIMS 或 CMC 文件中。

結(jié)語

綜上所述，Edman 降解法測(cè)序作為最早實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化蛋白 N 端解析的化學(xué)技術(shù)，在現(xiàn)代蛋白質(zhì)組學(xué)與生物制劑質(zhì)控中仍占據(jù)不可替代地位。它以化學(xué)專一性高、循環(huán)效率穩(wěn)定、對(duì)數(shù)據(jù)庫零依賴等優(yōu)勢(shì)，為驗(yàn)證未知蛋白 N 端序列、定位截短/剪切及評(píng)估翻譯后修飾遮蔽提供了獨(dú)到捷徑；同時(shí)，它也受限于起始氨基依賴、讀長(zhǎng)有限和反應(yīng)條件苛刻等缺點(diǎn)。隨著百泰派克將酶促脫保護(hù)、納流捕集、質(zhì)譜耦合及智能演算法多維度整合，新一代 Edman 流程已經(jīng)能夠在分析通量、準(zhǔn)確性與讀長(zhǎng)上取得突破，為基礎(chǔ)研究人員與生物制劑開發(fā)者提供更加靈活、可靠且經(jīng)濟(jì)的序列驗(yàn)證服務(wù)。借助這套升級(jí)方案，科研人員不僅能夠在單條帶、低納摩爾水平迅速獲得起始序列，還可對(duì)復(fù)雜融合蛋白或跨膜片段進(jìn)行分段驗(yàn)證，進(jìn)一步縮短研發(fā)周期、提高結(jié)構(gòu)功能研究的縱深度。

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關(guān)于我們

北京百泰派克生物科技有限公司致力于為生物/制藥和醫(yī)療器械行業(yè)提供質(zhì)量控制檢測(cè)和項(xiàng)目驗(yàn)證等專業(yè)服務(wù)。公司實(shí)驗(yàn)室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法規(guī)和指導(dǎo)原則，通過CNAS/ISO9001雙重質(zhì)量體系認(rèn)證，建立了完備的質(zhì)量體系，數(shù)據(jù)冷熱/異地備份，設(shè)備定期計(jì)量/期間核查，軟件審計(jì)追蹤，為客戶提供一體化解決方案和技術(shù)服務(wù)，支持新藥研發(fā)、藥物申報(bào)注冊(cè)和生產(chǎn)放行。

1.公司采用ISO9001質(zhì)量控制體系，專業(yè)提供以質(zhì)譜為基礎(chǔ)的CRO檢測(cè)分析服務(wù)；

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