一、背景

成骨細胞分化培養(yǎng)基是專門為正常人類成骨細胞體外培養(yǎng)設計的其生長的培養(yǎng)基。是經(jīng)滅菌的液體培養(yǎng)基，包含必需和非必需氨基酸、維生素、有機和無機化合物、激素、生長因子、微量礦物質(zhì)和低濃度胎牛血清(5%)。該培養(yǎng)基緩沖體系為重碳酸鹽，在含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中平衡后pH值為7.4。該培養(yǎng)基的配方能夠選擇性的促進正常人類微血管內(nèi)皮細胞體外培養(yǎng)中的增殖和生長，并為其達到營養(yǎng)平衡狀態(tài)。

成骨細胞(osteoblast，OB)主要由內(nèi)外骨膜和骨髓中基質(zhì)內(nèi)的間充質(zhì)始祖細胞分化而來，能特異性分泌多種生物活性物質(zhì)，調(diào)節(jié)并影響骨的形成和重建過程。

在不同成熟時期，成骨細胞在體內(nèi)表現(xiàn)為4種不同形態(tài)，即前成骨細胞(preosteoblast)、成骨細胞(osteoblast)、骨細胞(osteocyte)和隊形細胞(bonesliningcell)。前成骨細胞是成骨細胞的前體，由基質(zhì)干細胞分化，沿著成骨細胞譜系發(fā)育而成，位于覆蓋骨形成表面的成骨細胞的外側(cè)。成熟的成骨細胞是位于骨表面的單層細胞，承擔著合成骨基質(zhì)的重要功能。

骨細胞是在成骨細胞系譜中成熟和的分化細胞。骨細胞包埋于礦化骨組織中，淺表骨細胞仍然保留部分成骨細胞結(jié)構(gòu)。隊形細胞是排列于成體大部分骨表面的一層形態(tài)扁平或呈長方形的細胞?；钴S的成骨細胞為梭形、錐形或立方形，胞漿嗜堿性。細胞核位于細胞的一端，核仁明顯，表面有短的突起與相鄰細胞連接。電鏡下胞漿內(nèi)具有典型的蛋白合成結(jié)構(gòu)——豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及核糖體，高爾基體較發(fā)達。

二、應用

成骨細胞分化培養(yǎng)基可以用于MKRN1通過增強PPARγ泛素化降解促進MC3T3-E1細胞成骨分化的研究：

探索E3泛素連接酶MKRN1在MC3T3-E1細胞成骨分化過程中的作用,為骨質(zhì)疏松類疾病的治療提供新的方案和依據(jù)。

研究方法：

1、MKRN1對MC3T3-E1細胞成骨分化的影響RT-qPCR和Western Blot檢測MC3T3-E1細胞成骨分化過程中MKRN1 mRNA和蛋白表達量與時間的相關性。構(gòu)建腺病毒載體感染MC3T3-E1細胞過表達或敲低MKRN1,成骨分化誘導后檢測ALP活性;RT-qPCR、Western Blot檢測Runx2、Co L1A1、OCN的表達水平;茜素紅染色檢測礦化結(jié)節(jié)形成情況。

2、MKRN1和PPARγ共同作用對MC3T3-E1細胞成骨分化的影響腺病毒載體感染MC3T3-E1細胞,敲低MKRN1與PPARγ的表達后誘導細胞成骨分化,檢測ALP活性;RT-qPCR、Western Blot檢測Runx2、Co L1A1、OCN的表達水平;茜素紅染色檢測礦化結(jié)節(jié)形成情況。

3、MKRN1對MC3T3-E1細胞中PPARγ表達的影響Western Blot檢測過表達或敲低MKRN1對細胞內(nèi)PPARγ蛋白表達水平的影響;Co-IP檢測MC3T3-E1細胞內(nèi)源性MKRN1和PPARγ結(jié)合情況;Co-IP檢測過表達MKRN1后細胞內(nèi)PPARγ蛋白的泛素化水平;Western Blot檢測添加MG132后,過表達MKRN1對于細胞內(nèi)PPARγ表達情況的影響。

結(jié)果：

1、MC3T3-E1細胞成骨分化過程中,MKRN1 mRNA和蛋白的表達水平隨著分化時間延長而升高;腺病毒載體能夠穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MC3T3-E1細胞,實現(xiàn)MKRN1過表達或敲低;敲低MKRN1表達后,與空白對照組和陰性轉(zhuǎn)染組相比較,ALP活性,Runx2、COL1A1和OCN mRNA和蛋白的表達均顯著降低,礦化結(jié)節(jié)形成減少(P<0.05);MKRN1過表達的MC3T3-E1細胞ALP活性,Runx2、COL1A1和OCN mRNA及蛋白表達量及礦化結(jié)節(jié)形成均高于空白對照組和空載轉(zhuǎn)染組(P<0.05)。

2、腺病毒載體能夠穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MC3T3-E1細胞,干擾PPARγ的表達;干擾MC3T3-E1細胞中PPARγ的表達,可以逆轉(zhuǎn)MKRN1敲低后對細胞成骨分化和礦化功能的抑制作用。

3、MC3T3-E1細胞成骨分化顯著降低PPARγ蛋白表達水平;敲低MKRN1表達后PPARγ蛋白表達水平升高,而過表達MKRN1降低了PPARγ蛋白表達(P<0.01);Co-IP證實了內(nèi)源性MKRN1和PPARγ在細胞中具有相互作用;MKRN1過表達提高了PPARγ的泛素化水平;加入MG132逆轉(zhuǎn)了過表達MKRN1對PPARγ表達的抑制作用。

結(jié)論：

1、E3泛素連接酶MKRN1促進MC3T3-E1細胞的成骨向分化。

2、在MC3T3-E1細胞成骨分化過程中,MKRN1通過增強PPARγ泛素化降解發(fā)揮功能。

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