大體積轉(zhuǎn)染是貫穿整個(gè)細(xì)胞和基因治療流程的重要工具，無(wú)論是早期研究、臨床前階段還是先進(jìn)治療藥物（ATMP）的生產(chǎn)。

隨著細(xì)胞和基因治療向臨床轉(zhuǎn)化推進(jìn)，規(guī)?；芰o(wú)疑成為一項(xiàng)要求。此外，記錄工藝中所用原材料是否符合GMP規(guī)范以確?；颊甙踩沧兊迷絹?lái)越重要。

無(wú)論您仍處于研究階段還是向臨床或商業(yè)化邁進(jìn)，4D-Nucleofector® LV單元都能幫助您應(yīng)對(duì)這些挑戰(zhàn)。該系統(tǒng)支持封閉式、可擴(kuò)展的轉(zhuǎn)染，最高可達(dá)10億細(xì)胞，并提供用于研究用途和GMP生產(chǎn)的耗材，以及符合21 CFR part 11要求的軟件。

4D-Nucleofector® LV單元在其非病毒、離體細(xì)胞和基因治療流程中高效修飾大體積細(xì)胞。該技術(shù)的應(yīng)用范圍涵蓋從研究到臨床階段，包括mRNA、CRISPR敲除、堿基或先導(dǎo)編輯等多種方法。

4D-Nucleofector® LV單元與堿基編輯

Chiesa等人（2023）

《堿基編輯的CAR7 T細(xì)胞治療復(fù)發(fā)性T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病》

《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》389(10):899-910

階段：I期臨床試驗(yàn)

疾病：急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）

治療：CAR-T細(xì)胞（異體）

基因修飾方法：

作者結(jié)合堿基編輯（胞苷脫氨）滅活CD52、CD7和TCR β鏈以防止移植物抗宿主病，隨后通過(guò)慢病毒整合CD7特異性CAR。堿基編輯步驟中，健康供體外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）經(jīng)2天激活后，使用4D-Nucleofector® LV單元轉(zhuǎn)染coBE mRNA（編碼堿基編輯器蛋白：一種催化受損的Cas9切口酶與大鼠來(lái)源的單鏈DNA脫氨酶和尿嘧啶糖基化酶融合）及靶向TRBC1和TRBC2的sgRNA。次日，細(xì)胞進(jìn)行CAR插入的轉(zhuǎn)導(dǎo)，培養(yǎng)10天后冷凍保存。CD52、CD7和TCR的敲除效率為92%至99%。

在I期試驗(yàn)中，3名復(fù)發(fā)性ALL兒童接受了這種異體CAR-T細(xì)胞治療的安全性評(píng)估。研究驗(yàn)證了堿基編輯作為治療方法的可行性，但也指出了免疫治療中可能出現(xiàn)的并發(fā)癥。

Woodruff等人（2023）

《大規(guī)模生產(chǎn)堿基編輯的嵌合抗原受體T細(xì)胞》

《分子治療方法與臨床發(fā)展》31:101123

階段：臨床前

疾病：N/A

治療：CAR-T細(xì)胞（異體）

基因修飾方法：

研究人員通過(guò)堿基編輯敲除健康供體T細(xì)胞中的PD-1，隨后用慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)抗CD19 CAR。在堿基編輯中，他們比較了線性mRNA與環(huán)狀mRNA的效果。小規(guī)模驗(yàn)證后，將應(yīng)用擴(kuò)展至大規(guī)模生產(chǎn)臨床劑量的1×108 CAR-T細(xì)胞。簡(jiǎn)言之，經(jīng)2天激活的PBMCs或CD4+/CD8? T細(xì)胞以5×10? mL的濃度轉(zhuǎn)染不同量的BE4max環(huán)狀RNA和靶向PD-1的sgRNA。轉(zhuǎn)染后一天，細(xì)胞進(jìn)行抗CD19 CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)，再培養(yǎng)9天。根據(jù)環(huán)狀mRNA用量，堿基轉(zhuǎn)換效率為86%至接近轉(zhuǎn)換。

作者證明，在臨床規(guī)模下使用環(huán)狀mRNA能以8倍更少的RNA實(shí)現(xiàn)更高的編輯效率，從而顯著降低成本。

Georgiadis等人（2021）
《堿基編輯的CAR T細(xì)胞用于T細(xì)胞惡性腫瘤的聯(lián)合治療》
《白血病》35(12):3466-3481

階段：臨床前
疾病：T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血?。═-ALL）
治療：CAR-T細(xì)胞（異體）

基因修飾方：
倫敦大學(xué)學(xué)院的研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)堿基編輯（或CRISPR NHEJ）敲除TCR/CD3和CD7，隨后慢病毒引入CAR。敲除CD3和CD7旨在避免治療T細(xì)胞惡性腫瘤時(shí)的“自相殘殺”。簡(jiǎn)言之，從健康供體分離PBMCs并激活，隨后用靶向TCR恒定β鏈（TRBC）和CD7的sgRNA及SpCas9 mRNA或coBE3 dCas9 mRNA通過(guò)4D-Nucleofector® LV單元轉(zhuǎn)染。24小時(shí)后，細(xì)胞用慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)，表達(dá)靶向CD3（3CAR）和CD7（7CAR）的CAR。結(jié)果顯示，CAR表達(dá)穩(wěn)健，TCRαβ/CD3和CD7的表面表達(dá)單敲除效率為50%至>95%，雙敲除為37%至60%。3CAR和7CAR共培養(yǎng)可實(shí)現(xiàn)“自我富集”，獲得99.6% TCR–/CD3–/CD7–細(xì)胞群體。這些細(xì)胞表現(xiàn)出特異性細(xì)胞毒性，無(wú)脫靶活性或堿基轉(zhuǎn)換問(wèn)題。3CAR和7CAR T細(xì)胞還在人源化小鼠異種移植模型中評(píng)估了抗白血病效力。

4D-Nucleofector® LV單元與CRISPR敲除

Ottoviano等人（2022）
《CRISPR工程化CAR19通用T細(xì)胞治療難治性B細(xì)胞白血病兒童的I期臨床試驗(yàn)》
《科學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)》14, eabq3010

階段：I期臨床試驗(yàn)
疾?。築細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血?。˙-ALL）
治療：CAR-T細(xì)胞（異體）

基因修飾方法：
作者結(jié)合慢病毒引入靶向CD19的CAR和CRISPR gRNA（靶向TRAC和CD52），并通過(guò)非病毒方式傳遞Cas9 mRNA。簡(jiǎn)言之，健康供體的PBMCs激活1天后，用慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)編碼抗CD19 CAR基因及靶向TRAC和CD52的sgRNA以實(shí)現(xiàn)多重編輯。3天后，細(xì)胞通過(guò)4D-Nucleofector® LV單元轉(zhuǎn)染Cas9 mRNA。轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞進(jìn)一步擴(kuò)增，7天后通過(guò)磁珠去除殘留的TCRαβ表達(dá)T細(xì)胞。該方法實(shí)現(xiàn)了86%至98%的CAR19表達(dá)，殘留TCR表達(dá)為0.1%至1%。

在I期臨床試驗(yàn)中，6名難治/復(fù)發(fā)性CD19陽(yáng)性B-ALL兒童接受了治療。研究證明了CRISPR免疫療法的可行性、安全性和治療潛力，其中2名兒童病情緩解。

Vazquez-Lombardi等人（2022）
《通過(guò)功能篩選的高通量T細(xì)胞受體工程鑒定出效力和特異性增強(qiáng)的候選分子》
《免疫》55:1953–1966

階段：研究
疾?。篘/A
治療：TCR

基因修飾方法：
本研究旨在開發(fā)一種識(shí)別高效力和高特異性工程化T細(xì)胞受體（TCR）的方法。建立的“TCR引擎”高通量方法結(jié)合了CRISPR基因組編輯、計(jì)算TCR設(shè)計(jì)和深度測(cè)序。簡(jiǎn)言之，通過(guò)CRISPR-Cas使用小規(guī)模4D-Nucleofector® X單元修飾Jurkat細(xì)胞，生成TCR受體細(xì)胞。通過(guò)五步連續(xù)整合Cas9、人CD8、NFAT-GFP和mRuby（通過(guò)HDR），并刪除內(nèi)源性CD4、TCRα和Fas（通過(guò)NHEJ）。每一步后，通過(guò)流式分選細(xì)胞并測(cè)序驗(yàn)證。隨后設(shè)計(jì)靶向MAGE-A3（TCR-A3）的>30種突變TCR變體的組合HDR模板庫(kù)，與靶向內(nèi)源性TCRβ的gRNA一起通過(guò)4D-Nucleofector® LV單元轉(zhuǎn)染1億細(xì)胞。通過(guò)綜合篩選程序鑒定出目標(biāo)識(shí)別增強(qiáng)的TCR變體，并在原代T細(xì)胞中進(jìn)一步驗(yàn)證其安全性和效力。

Lattanzi等人（2021）
《人類造血干細(xì)胞中β-珠蛋白基因校正的開發(fā)作為鐮狀細(xì)胞病的潛在持久治療》
《科學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)》13(598):eabf2444

階段：臨床前（支持IND的研究）
疾病：鐮狀細(xì)胞?。⊿CD）
治療：基因校正

基因修飾方法：
研究人員結(jié)合非病毒電穿孔遞送CRISPR RNP和重組腺相關(guān)病毒遞送HDR模板，校正導(dǎo)致SCD的β-珠蛋白（HBB）基因點(diǎn)突變。臨床規(guī)模下，60%的HBB等位基因得到校正。移植至NSG小鼠后觀察到20%的基因校正，且未發(fā)現(xiàn)基因毒性或致瘤性。

4D-Nucleofector® LV與病毒生產(chǎn)

Nawandar等人（2022）
《通過(guò)合成基因組重組表達(dá)生產(chǎn)的人細(xì)小病毒》（bioRxiv預(yù)印本）

階段：研究
疾?。篘/A

基因修飾方法：

細(xì)小病毒（Anelloviruses）在人類中普遍存在，但免疫原性較低且不致病。因此，基于這些病毒開發(fā)基因療法可能成為其他常用病毒的有力替代方案，并允許重復(fù)給藥。目前，由于缺乏體外生產(chǎn)該病毒的系統(tǒng)，其生物學(xué)特性尚未得到廣泛研究。

本研究通過(guò)轉(zhuǎn)染T細(xì)胞來(lái)源的MOLT-4細(xì)胞系，成功實(shí)現(xiàn)了兩種β扭轉(zhuǎn)病毒（Betatorquevirus，細(xì)小病毒屬之一）的重組生產(chǎn)。實(shí)驗(yàn)中使用的質(zhì)粒編碼該病毒屬的LY2基因組或nrVL4619基因組。簡(jiǎn)而言之，小規(guī)模試驗(yàn)（轉(zhuǎn)染1000萬(wàn)細(xì)胞）后，進(jìn)一步擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模：使用4D-Nucleofector® LV Unit系統(tǒng)，在20 mL連續(xù)流工藝中轉(zhuǎn)染20億細(xì)胞（質(zhì)粒用量2 mg）。分析內(nèi)容包括病毒基因表達(dá)、復(fù)制、電子顯微鏡成像以及組織特異性體內(nèi)感染實(shí)驗(yàn)。該工作為這一潛力病毒家族的后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

大體積轉(zhuǎn)染模塊: 4D-Nucleofectorm LV 模塊優(yōu)勢(shì)

-封閉的系統(tǒng)-核轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)量多達(dá)109個(gè)規(guī)?？烧嬲糯?/p>

-以少量樣品建立方法成熟的轉(zhuǎn)染方案

-超過(guò)700多個(gè)優(yōu)化細(xì)胞類型操作簡(jiǎn)單-極少的培訓(xùn)需求

-4D-Nucleofector LogWare-可使用符合21CFR part 11的軟件進(jìn)行操作

-TheraPEAK Nucleofector耗材-加快滿足GMP過(guò)程要求的進(jìn)度