樹突狀細(xì)胞（dendritic cells,DC)是目前所知的功能的抗原呈遞細(xì)胞，因其成熟時(shí)伸出許多樹突樣或偽足樣突起而得名。DC參與免疫應(yīng)答的啟動(dòng)和調(diào)節(jié)，在腫瘤學(xué)及其他學(xué)科的作用也日益受到重視。人外周血中DC含量很少，僅占單個(gè)核細(xì)胞的0.1％～1%。利用細(xì)胞黏附和密度梯度離心的方法雖然可分離純化外周血樹突狀細(xì)胞，但此法分離的DC，不僅純度低，數(shù)量少，而且處于不同的分化階段，已難以滿足臨床研究的需要。隨著人們對(duì)DC發(fā)生學(xué)的認(rèn)識(shí)不斷深入，許多學(xué)者開始用多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)不同的前體細(xì)胞沿著不同的分化途徑在體外擴(kuò)增DC。

一、人外周血單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)DC

外周血中DC前體（CD34+細(xì)胞）有進(jìn)一步分化的潛能。在外周血單個(gè)核細(xì)胞體外培養(yǎng)中，添加一定劑量的粒細(xì)胞單核細(xì)胞一集落刺激因子（GM-CSF）和白細(xì)胞介素-4(IL-4),DC前體細(xì)胞可分化成樹突狀細(xì)胞，而僅在GM-CSF條件下培養(yǎng)，則該前體細(xì)胞分化成巨噬細(xì)胞。IL-4具有抑制巨噬細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。加入TNF-α共同培養(yǎng)，可促進(jìn)DC的成熟。

（一）材料

1、分離外周血單個(gè)核細(xì)胞所需試劑；

2、10% FCS的RPMI 1640培養(yǎng)液；

3、IL-4,GM-CSF,TNF-α。

（二）方法

1、常規(guī)方法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，并通過(guò)玻璃吸附法獲得單核細(xì)胞。

2、用10% FCS的RPMI 1640培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞濃度為106/ml。

3、將單核細(xì)胞懸液加入24孔培養(yǎng)板中，1 ml／孔，并加入IL-4(50ng）與GM-CSF(100ng),置37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3天后用含有IL-4與GM-CSF及10% FCS的RPMI 1640培養(yǎng)液半量換液。

4、培養(yǎng)7天后，換用含TNF-α 20ng/ml的RPMI 1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)2～7天后顯微鏡下觀察，可見(jiàn)樹突狀細(xì)胞比淋巴細(xì)胞大，直徑在10～20um之間，有許多刺狀突起，分布于細(xì)胞表面。

（三）結(jié)果

收集懸浮細(xì)胞，洗滌后重懸于RPMI 1640培養(yǎng)液中備用。

（四）注意事項(xiàng)

1、進(jìn)行半量換液時(shí)，注意不要將細(xì)胞吸出。

2、可以用IL-13替代IL-4，與GM-CSF構(gòu)成聯(lián)合培養(yǎng)體系。因其與IL-4具有相似的性質(zhì)。

3、DC細(xì)胞尚無(wú)特異性標(biāo)記，上述分離細(xì)胞表面標(biāo)記應(yīng)為CD3（-）、CD4（-）、CD8（-）、CD19（-）,CD21（-）,CD16（-）,CD14（-）和MHC-Ⅱ（+），可以用FCM或免疫熒光法分析鑒定。

二、DC的功能檢測(cè)

DC在分離過(guò)程中和分離后，只要與培養(yǎng)器皿接觸發(fā)生黏附，即可被活化，此時(shí)檢測(cè)到的細(xì)胞功能已不準(zhǔn)確；此外，通過(guò)分離獲得的DC，其中包含功能各不一致的多種群體。因此，對(duì)DC功能的檢測(cè)尚無(wú)統(tǒng)一的方法。目前檢測(cè)DC功能的方法有：

1、DC抗原捕獲能力的檢測(cè)，收集DC，配成1x106/ml細(xì)胞懸液，取100ul加入等量FITC標(biāo)記的葡聚糖，37℃靜置60分鐘，PBS洗兩次，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度。

2、利用混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)（MLC)的方法檢測(cè)DC的功能，如果能增強(qiáng)MLC，說(shuō)明DC具有呈遞抗原的作用。但這僅僅能反映一部分DC的功能，有部分DC具有誘導(dǎo)特異性免疫耐受的作用，因此不能增強(qiáng)MLC的反應(yīng)強(qiáng)度，反而抑制MLC的反應(yīng)強(qiáng)度。

3、采用特異性抗原預(yù)處理DC后，再與淋巴細(xì)胞孵育，觀察淋巴細(xì)胞的增殖情況，由于對(duì)特異性抗原發(fā)生免疫應(yīng)答的淋巴細(xì)胞較少，故一般只有采用3H-TdR摻入等敏感的方法檢測(cè)。

4、利用某些刺激劑，如金黃色葡萄球菌，可以刺激DC分泌IL-12，通過(guò)檢測(cè)DC分泌的IL-12的量來(lái)反映DC的功能。

北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司擁有對(duì)菌種、細(xì)胞、培養(yǎng)基、配套試劑等產(chǎn)品需求者的極優(yōu)質(zhì)服務(wù)，對(duì)購(gòu)買項(xiàng)目的前期資料提供,中期合同保證,后期貨物跟蹤到最終售后的確保項(xiàng)目準(zhǔn)確到位，都有相關(guān)人士進(jìn)行維護(hù),確保您在微生物菌種查詢網(wǎng)中獲得優(yōu)質(zhì)服務(wù)！也正因?yàn)榇耍本┌贇W博偉生物技術(shù)有限公司與國(guó)內(nèi)外多家研制單位、生物制藥、第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)和科研院所院校、化工企業(yè)有著良好、長(zhǎng)期和穩(wěn)定的合作關(guān)系！