穿心蓮內(nèi)酯（andrographolide）是從爵床科植物穿心蓮（Andrographis paniculata）中提取的 ent- 半日花烷型二萜類單體化合物，具有顯著的抗炎活性，其工業(yè)化生產(chǎn)目前仍完全依賴植物提取。雖然穿心蓮內(nèi)酯的二萜骨架 ent-copalyl diphosphate（ent-CPP）已實現(xiàn)生物合成，但其后續(xù)的氧化修飾機制長期未被闡明。

團隊前期研究表明，穿心蓮內(nèi)酯的生物合成受到茉莉酸甲酯（MeJA）的誘導。茉莉酸甲酯處理條件下，骨架合成基因 ApCPS2 表達模式和穿心蓮內(nèi)酯積累模式一致。通過將茉莉酸甲酯處理后基因組注釋的 CYP450s 基因和 ApCPS2 進行相關性分析，在 r>0.85 閾值下篩選到 20 個與 ApCPS2 表達高度相關的 CYP450 候選基因（圖 1）。

將候選 CYP450s 逐一與 ent-copalol 合成基因（AstHMGR，AgGGPPS 和 ZmCPS2）在煙草中進行瞬時表達發(fā)現(xiàn)，僅有 ApCYP71D587 和 ApCYP71BE50 可催化 ent-copalol 產(chǎn)生新化合物。通過分離純化確認 ApCYP71D587 催化 ent-copalol 形成 19-hydroxy-ent-copalol；ApCYP71BE50 催化 ent-copalol 生成了主產(chǎn)物 ent-15，16-epoxy-labda-8（17），13（14）-diene、ent-15，16-epoxy-labda-8（17），13（16），14-triene 以及副產(chǎn)物 19-dehydroxy-andrograpanin（圖 3）；考慮到 ApCYP71BE50 能夠催化 ent-copalol 形成內(nèi)酯環(huán)，研究人員將 ApCYP71D587、ApCYP71BE50 以及 ent-copalol 合成基因在煙草中進行了共注射，確認在煙草中生成了合成路徑中的關鍵中間體—新穿心蓮內(nèi)酯苷元（andrograpanin）（圖 2）。

隨后，以新穿心蓮內(nèi)酯苷元作為底物對其余 CYP450s 進行功能驗證發(fā)現(xiàn)，ApCYP706U5 催化新穿心蓮內(nèi)酯苷元生成 14-deoxyandrographolide；ApCYP72F1 可催化新穿心蓮內(nèi)酯苷元生成 3-dehydroxy-andrographoide（圖 3）。進一步將 ApCYP706U5 和 ApCYP72F1 與新穿心蓮內(nèi)酯苷元合成基因在煙草葉片共表達后觀察到了穿心蓮內(nèi)酯（andrographoide）的生成（圖 2）。

利用安捷倫的氣質和液質產(chǎn)品，研究人員在酵母微粒體催化實驗中進一步驗證了上述 P450 的催化功能。同時，利用煙草瞬時轉化進一步驗證了上述四個 P450 對不同底物的催化功能，提出了穿心蓮內(nèi)酯在藥用植物穿心蓮中可能存在生物合成路徑（圖 3）。該研究成果為理解二萜類次生代謝產(chǎn)物的生物合成、穿心蓮內(nèi)酯及其衍生物的異源生物制造和穿心蓮新品種培育奠定了基礎。

參考文獻

[1] Sun W, Wang S, Liang M, et al. Completing the Biosynthesis of the Clinically Important Diterpenoid Andrographolide in Andrographis paniculata[J]. Angewandte Chemie, e202425303.