Piezo1 opposes age-associated cortical bone loss

Keywords: Piezo1; age-associated bone loss; endocortical bone resorption; mechanical stimulation.

衰老會(huì)導(dǎo)致松質(zhì)骨和皮質(zhì)間隔的骨質(zhì)流失。隨著年齡的增長(zhǎng)，松質(zhì)骨骨質(zhì)丟失與骨形成減少和骨重塑率低有關(guān)。相比之下，與衰老相關(guān)的皮質(zhì)骨骨質(zhì)丟失主要是由于皮質(zhì)內(nèi)表面破骨細(xì)胞數(shù)量和骨吸收的增加。在皮質(zhì)骨中，編碼RANKL（一種對(duì)破骨細(xì)胞形成至關(guān)重要的細(xì)胞因子）的腫瘤壞死因子配體超家族成員11（Tnfsf11）隨著年齡的增長(zhǎng)而增加，RANKL的誘餌受體骨保護(hù)素（OPG）隨著年齡的增長(zhǎng)而減少，證明了破骨細(xì)胞形成增加在年齡相關(guān)的皮質(zhì)骨丟失中的重要性。

機(jī)械刺激，如來(lái)自身體活動(dòng)的刺激，通過(guò)增加成骨細(xì)胞的數(shù)量和活性來(lái)促進(jìn)骨骼形成。相反，機(jī)械刺激的缺失通過(guò)促進(jìn)破骨細(xì)胞形成和骨吸收導(dǎo)致骨質(zhì)流失。因此，成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞都受到機(jī)械刺激的調(diào)控。此外，骨骼對(duì)機(jī)械負(fù)荷的合成代謝反應(yīng)隨著年齡的增長(zhǎng)而減弱，表明老骨頭感知和/或轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)械刺激的能力降低。這表明，機(jī)械刺激的減少會(huì)導(dǎo)致與年齡相關(guān)的骨質(zhì)流失。

Piezo1 是一種機(jī)械敏感離子通道，能夠感應(yīng)各種機(jī)械刺激，包括膜拉伸、基質(zhì)剛度和流體剪切應(yīng)力，并在許多器官的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。刪除成骨細(xì)胞系細(xì)胞中的 Piezo1 基因，證明了 Piezo1 在骨穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用。

基于此，美國(guó)阿肯色大學(xué)醫(yī)學(xué)院骨科及肌肉骨骼疾病研究中心團(tuán)隊(duì)探討了 Piezo1 在成骨細(xì)胞譜系細(xì)胞中的表達(dá)是否在與年齡相關(guān)的骨質(zhì)流失中起重要作用，發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增長(zhǎng)，成骨細(xì)胞系細(xì)胞中 Piezo1 缺失的小鼠比對(duì)照小鼠失去更多的皮質(zhì)骨，這與皮質(zhì)內(nèi)表面破骨細(xì)胞數(shù)量的增加顯著相關(guān)。研究結(jié)果表明，Dmp1-Cre 靶細(xì)胞中的 Piezo1 表達(dá)對(duì)骨穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，并介導(dǎo)骨骼對(duì)機(jī)械刺激的反應(yīng)。研究成果發(fā)表于 Aging Cell  期刊題為“Piezo1 opposes age-associated cortical bone loss”。

首先，為了確定 Piezo1 表達(dá)是否隨著年齡的增長(zhǎng)而變化，比較了不同小鼠品系 6 月齡和 24 月齡小鼠脛骨皮質(zhì)骨中的 Piezo1 表達(dá)，均發(fā)現(xiàn)其在 24 月齡小鼠皮質(zhì)骨中的表達(dá)顯著降低。除小鼠外，還比較了年輕人和老年人受試者股骨頸皮質(zhì)骨中 Piezo1 的表達(dá)，結(jié)果顯示，與年輕人相比，老年人的 Piezo1 表達(dá)也有類(lèi)似的降低。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這些發(fā)現(xiàn)，對(duì)小鼠和人類(lèi)骨骼樣本進(jìn)行了 RNAscope，發(fā)現(xiàn)老齡鼠股骨和老年人類(lèi)股骨頸皮質(zhì)骨中的 Piezo1 mRNA 降低，與基因表達(dá)分析一致。這證明，衰老與骨骼中 Piezo1 表達(dá)降低之間存在相關(guān)性，Piezo1 表達(dá)的降低可能在與年齡相關(guān)的骨骼變化中發(fā)揮作用。

為了確定成骨細(xì)胞系細(xì)胞中 Piezo1 的表達(dá)是否在與年齡相關(guān)的骨質(zhì)流失中發(fā)揮作用，構(gòu)建 Dmp1-Cre 轉(zhuǎn)基因靶細(xì)胞 Piezo1 條件性敲除小鼠（Dmp1‐Cre; Piezo1f/f）。正如預(yù)期，與 6 月齡小鼠相比，對(duì)照小鼠在 24 月齡時(shí)表現(xiàn)出與年齡相關(guān)的松質(zhì)骨丟失，相比之下，條件性敲除小鼠在年輕時(shí)松質(zhì)骨骨量低于對(duì)照組，但不會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)而進(jìn)一步丟失（圖1 a）。股骨皮質(zhì)骨分析顯示，對(duì)照小鼠在 24 月齡時(shí)比 6 月齡的皮質(zhì)厚度更低（圖1 b）。有趣的是，老齡條件性敲除小鼠與對(duì)照小鼠相比，皮質(zhì)厚度隨著年齡的增長(zhǎng)而下降更嚴(yán)重（圖1 b）。與此一致，24 月齡的條件性敲除小鼠表現(xiàn)出自發(fā)性脛骨骨折，而在年輕小鼠或老齡對(duì)照組中均未觀察到骨折（圖1 c）。這些結(jié)果表明，即使從較低的皮質(zhì)厚度開(kāi)始，成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞中缺失 Piezo1 的小鼠也會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)而失去更多的皮質(zhì)骨。

為了確定皮質(zhì)骨丟失的部位，測(cè)量了股骨中軸的骨膜和骨內(nèi)膜周長(zhǎng)。顯微 CT 分析顯示，對(duì)照小鼠的骨膜周長(zhǎng)隨著年齡的增長(zhǎng)而增加，成年條件性敲除小鼠與對(duì)照小鼠相比，小鼠的骨膜周長(zhǎng)隨年齡的增長(zhǎng)表現(xiàn)出明顯的增加（圖1 d）。在對(duì)照組和條件性敲除組中，骨內(nèi)膜周長(zhǎng)均增加，但條件性敲除小鼠的這種增加大于對(duì)照小鼠（圖1 e）。一致地，條件性敲除小鼠在股骨中軸測(cè)量的極慣性矩隨年齡的增加被減弱（圖1 f），且比對(duì)照小鼠產(chǎn)生更多的皮質(zhì)孔隙（圖1 g、h）。這些結(jié)果表明，Dmp1-Cre 靶向細(xì)胞中的 Piezo1 缺失增加了老齡小鼠的皮質(zhì)內(nèi)擴(kuò)張和皮質(zhì)骨孔隙率，說(shuō)明條件性敲除小鼠皮質(zhì)骨隨著年齡的增長(zhǎng)而丟失更多是由于皮層內(nèi)骨吸收的增加。

圖1    隨著年齡的增長(zhǎng)，成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞中 Piezo1 的缺失加劇了皮質(zhì)骨骨質(zhì)流失。

接下來(lái)，為了了解骨骼表型的細(xì)胞基礎(chǔ)，測(cè)量了股骨皮質(zhì)內(nèi)表面的破骨細(xì)胞數(shù)量和表面。TRAP 染色顯示，在兩種基因型中，老齡小鼠的骨細(xì)胞數(shù)量和骨內(nèi)膜表面都比年輕小鼠增多，且在條件性敲除小鼠中顯著升高（圖2 a、b）。為了確定骨細(xì)胞中 Piezo1 的缺失是否增強(qiáng)其支持破骨細(xì)胞形成的能力，敲低 MLO-Y4 細(xì)胞（一種骨細(xì)胞樣細(xì)胞系）中的 Piezo1，并在 M-CSF 存在下將這些細(xì)胞與骨髓衍生的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)。TRAP 染色顯示，與對(duì)照細(xì)胞相比，Piezo1 敲低細(xì)胞具有更強(qiáng)的支持破骨細(xì)胞形成的能力（圖2 c）。與染色一致，基因表達(dá)分析顯示 Piezo1 敲低培養(yǎng)物中破骨細(xì)胞標(biāo)志基因增加，包括 CtsK 和 Acp5（圖2 d）。相比之下，使用Yoda1 激活 Piezo1 會(huì)抑制骨細(xì)胞支持破骨細(xì)胞形成的能力，表現(xiàn)為共培養(yǎng) 7 天后 Acp5 表達(dá)降低（圖2 e）。此外，在體外培養(yǎng)股骨皮質(zhì)骨，并用 Yoda1 處理骨樣本 3 天，發(fā)現(xiàn) Yoda1 在股骨皮質(zhì)骨離體器官培養(yǎng)中降低了 Acp5 的表達(dá)（圖2 f）。這些結(jié)果表明，成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞中Piezo1 的缺失會(huì)促進(jìn)皮質(zhì)內(nèi)表面破骨細(xì)胞的形成。

為了進(jìn)一步了解 Piezo1 調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞形成的機(jī)制，分析了已知在破骨細(xì)胞生成中起關(guān)鍵作用的基因的表達(dá)水平，包括 Piezo1 敲低 MLO-Y4 細(xì)胞中的 Tnfsf11 和 Tnfrsf11b。結(jié)果顯示，Tnfrsf11b 在 Piezo1 敲低細(xì)胞中的表達(dá)顯著降低，Yoda1 激活 Piezo1 導(dǎo)致 Tnfrsf11b 表達(dá)顯著增加。同時(shí)，對(duì)小鼠左脛骨施加 5500 N 軸向壓縮載荷（4Hz）促進(jìn)了小鼠皮質(zhì)骨中 Piezo1 的表達(dá)和 Tnfrsf11b 的表達(dá)。這些數(shù)據(jù)表明，Piezo1 通過(guò)刺激骨細(xì)胞中的 Tnfrsf11b 表達(dá)來(lái)控制破骨細(xì)胞的形成。

此外，Tnfrsf11b 表達(dá)隨著年齡的增長(zhǎng)而降低，類(lèi)似于老齡小鼠中的 Piezo1 表達(dá)。重要的是，與年輕小鼠相比，Yoda1 誘導(dǎo)的 Tnfrsf11b 的增加在老齡小鼠分離的骨細(xì)胞中顯著減弱。因此，Piezo1 的缺失可能會(huì)進(jìn)一步降低老齡小鼠 Tnfrsf11b 的表達(dá)。為了確定 Piezo1 敲除小鼠中 Tnfrsf11b 的表達(dá)，進(jìn)行 RNAscope 測(cè)量皮質(zhì)骨中 Tnfrsf11b 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在基因敲除小鼠中表達(dá) Tnfrsf11b 的骨細(xì)胞百分比顯著下降。這些結(jié)果表明，Piezo1 通過(guò)上調(diào) Tnfrsf11b 表達(dá)來(lái)控制破骨細(xì)胞的形成。

圖2    成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞中 Piezo1 的缺失增加了皮質(zhì)內(nèi)表面破骨細(xì)胞的形成。

最后，為了研究 Piezo1 調(diào)節(jié) Tnfrsf11b 表達(dá)的機(jī)制，使用 MLO-Y4 細(xì)胞模型檢查了 Yoda1 誘導(dǎo)的 Tnfrsf11b 表達(dá)是否需要鈣內(nèi)流，因?yàn)?Piezo1 是一個(gè)鈣允許離子通道，而 Yoda1 在 MLO-Y4 細(xì)胞中誘導(dǎo)鈣內(nèi)流。在無(wú)鈣培養(yǎng)基中培養(yǎng) MLO-Y4 細(xì)胞，并用 Yoda1 處理，發(fā)現(xiàn) Yoda1 誘導(dǎo)的 Tnfrsf11b 表達(dá)在細(xì)胞外鈣不存在的情況下減弱（圖3 a）。用細(xì)胞內(nèi)鈣螯合劑 BAPTA 處理 MLO-Y4 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn) Yoda1 誘導(dǎo)的 Tnfrsf11b 表達(dá)在沒(méi)有游離細(xì)胞內(nèi)鈣的情況下被阻斷（圖3 b）。

然后，研究了鈣調(diào)蛋白（CaM）（一種介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)傳導(dǎo)的鈣結(jié)合蛋白）對(duì) Yoda1 誘導(dǎo)的 Tnfrsf11b 表達(dá)增加的影響。在氯化卡咪唑銨（CMZ，一種膜滲透性 CaM 拮抗劑）存在下用 Yoda1 處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)CMZ 抑制了 Tnfrsf11b 表達(dá)的增加（圖3 c）。因此，Ca2+ 和 CaM 是響應(yīng) Piezo1 激活而增加 Tnfrsf11b 表達(dá)所必需的。

Ca2+/CaM 已被證明可調(diào)節(jié)各種信號(hào)通路，包括 p38/MAPK、MEK/ERK、eNOS 和 mTOR 信號(hào)。此外，Piezo1 已被證明可調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞中的 p38、eNOS 和 mTOR 信號(hào)。因此，利用這些通路的抑制劑來(lái)確定它們是否是 Piezo1 誘導(dǎo)的 Tnfrsf11b 表達(dá)所必需的。結(jié)果顯示，mTOR 抑制劑 PP242 阻斷了 Yoda1 誘導(dǎo)的 Tnfrsf11b 表達(dá)（圖3 d）。其他通路抑制劑包括 SB203590（p38/MAPK 抑制劑）、PD98059（MEK/ERK 抑制劑）和 L-NAME（eNOS 抑制劑）不影響 Piezo1 激活誘導(dǎo)的 Tnfrsf11b 表達(dá)的增加 （圖3 e）。這些結(jié)果表明，Piezo1 通過(guò) Ca2+/CaM/mTOR 信號(hào)通路控制 Tnfrsf11b 的表達(dá)（圖3 f）。

圖3     Piezo1通過(guò)Ca2+/CaM/mTOR信號(hào)通路控制Tnfrsf11b的表達(dá)。

圖4    圖形概要

總之，該研究結(jié)果表明，機(jī)械負(fù)荷主要促進(jìn)幼齡生長(zhǎng)小鼠皮質(zhì)骨的骨形成，導(dǎo)致骨量和骨大小增加。然而，在老齡小鼠中，機(jī)械負(fù)荷主要抑制骨吸收并防止皮質(zhì)變薄和多孔隙。與此一致的是，隨著小鼠年齡的增長(zhǎng)，Piezo1 的作用從促進(jìn)骨形成轉(zhuǎn)變?yōu)橐种乒俏?。這些發(fā)現(xiàn)揭示了與年齡相關(guān)的骨質(zhì)流失的復(fù)雜機(jī)制，并強(qiáng)調(diào)了機(jī)械刺激在衰老過(guò)程中保持骨骼完整性的重要性，為預(yù)防與衰老相關(guān)的骨骼疾病的治療策略提供借鑒。

參考文獻(xiàn)：Li X, Zhang C, Bowman HH, Stambough JB, Stronach BM, Mears SC, Barnes LC, Ambrogini E, Xiong J. Piezo1 opposes age-associated cortical bone loss. Aging Cell. 2023 Jun;22(6):e13846. doi: 10.1111/acel.13846. Epub 2023 May 5. PMID: 37147884; PMCID: PMC10265162.

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