簡(jiǎn)介

反向柱層析法（Reverse Phase Column Chromatography, RPCC）是天然產(chǎn)物分離的重要手段之一，其核心作用是通過(guò)極性差異實(shí)現(xiàn)復(fù)雜混合物中目標(biāo)成分的純化，固定相為非極性（C18、C8 鍵合硅膠），流動(dòng)相為極性溶劑（水、甲醇、乙腈等）。極性越弱的成分與固定相作用越強(qiáng)，洗脫越慢，從而實(shí)現(xiàn)分離。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)制備型快速柱層析技術(shù)將正相柱層析組分按照極性大小洗脫，流動(dòng)相為甲醇、水，極性大的組分先被洗脫下來(lái)，極性小的組分后被洗脫下來(lái)，將洗脫下來(lái)的組分減壓旋干稱重，利用高效液相色譜查看分離效果。

實(shí)驗(yàn)

2.1 設(shè)備

• Buchi Pure C-810 純化分離系統(tǒng)

• BUCHI Rotavapor R-300

• 真空恒溫干燥箱

• 保干器

• 高效液相色譜

2.2 試劑及耗材

• 色譜柱 4g

• 1mL 一次性塑料注射器

• 500mL 圓底燒瓶

• 研缽

• 試劑（分析純）: 甲醇、水

2.3 樣品和準(zhǔn)備工作

樣品：正相柱層析的組分 G-12

將 G-12 保干后稱重得質(zhì)量 m=2.5775g，將該組分全部溶于甲醇（分析級(jí)）后倒入研缽中，加入該組分質(zhì)量 0.8 倍的 C-18 填料拌樣，拌干后裝入柱子中，又下至上按照 C-18 硅膠、樣品、保護(hù)硅膠填滿整根柱子。

2.4 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

極性組分分離過(guò)程包括快速分離制備色譜柱的活化、極性組分的分離、濃縮和稱重。 

2.4.1 色譜柱的活化

取一支色譜柱 4g 安裝在 Pure C-810 上，連接好溶劑、管路， 按照 表1 參數(shù)平衡色譜柱，充分活化。

表 1：色譜柱平衡參數(shù)

表 2：極性組分分離參數(shù)及洗脫梯度

2.4.2 極性組分的收集與濃縮

以 500mL 收集瓶為收集容器外置在一側(cè)，從洗脫開(kāi)始收集洗脫液。如 圖2 所示：

取干凈的 500mL 圓底燒瓶烘干，根據(jù)色譜分離圖譜將收集到的極性洗脫液轉(zhuǎn)入燒瓶中，旋蒸除去溶劑，將樣品轉(zhuǎn)移至西林瓶中，按照相同步驟收集濃縮相應(yīng)極性組分，將所有組分吹干后放入保干器中干燥24h后稱重。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行過(guò)程中，通過(guò)紫外檢測(cè)器我們可以觀察到樣品的出峰情況，可以根據(jù)此情況調(diào)整洗脫時(shí)間，盡可能的提高效率。

結(jié)果

3.1 G-12 的極性組分分離圖譜

3.2 G-12 極性組分含量

各極性組分質(zhì)量和與 G-12 樣品質(zhì)量相比并未有太大差距，證明利用此法樣品損耗量小。

3.3 分離效果高效液相色譜驗(yàn)證

將濃縮后的組分溶于適量色譜甲醇中，高效液相色譜分析條件為 20-95 甲醇 25min，100甲醇 10min，分離效果如 圖5 所示，結(jié)果表明各極性組分分離效果良好，并且將前 5min 的大峰單獨(dú)分離出來(lái)后，后 20min 的小峰均顯現(xiàn)出來(lái)，有助于分離單體化合物。

圖 5：極性組分高效液相色譜圖

結(jié)論

參考文獻(xiàn)