文獻標題：Phytochemical natural killer cells reprogram tumor microenvironment for potent immunotherapy of solid tumors
發(fā)表期刊：Biomaterials
IF：15.304
一作單位：北京理工大學生命科學學院
研究背景
過繼性細胞移植(ACT)是通過體外激活擴增供體淋巴細胞來誘導抗腫瘤免疫反應(yīng)，自然殺傷細胞(NK細胞)在ACT中具有毒性較低、反應(yīng)率更高及作用譜更廣等明顯優(yōu)勢。此外，由于NK細胞缺乏抗原特異性表面受體且不會引發(fā)移植物抗宿主病(GvHD)，使用同種異體NK細胞可加速治療進程。 激活NK細胞以增強其細胞毒性是提升NK療法療效的關(guān)鍵?；蚬こ淌悄壳捌毡榈?/span>NK細胞激活手段，然而NK細胞的轉(zhuǎn)染和基因操作難度遠高于T細胞，且基因工程產(chǎn)物仍存在諸多問題。作為替代方案，糖工程改造和脂質(zhì)體修飾等化學修飾方法也有報道，但這些方法通常存在效率低、穩(wěn)定性差的缺陷。 即便實現(xiàn)了有效激活，要在實體瘤中充分發(fā)揮過繼性NK細胞的治療潛力仍十分困難，因為腫瘤微環(huán)境(TME)中的多種免疫抑制機制會嚴重損害NK細胞的效應(yīng)功能。特別是缺氧條件和活性氧簇(ROS)會顯著抑制其抗腫瘤活性，甚至誘發(fā)NK細胞凋亡；而白細胞介素-37(IL-37)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)等癌癥相關(guān)因子還會通過多種途徑對NK功能產(chǎn)生負面影響。目前針對免疫抑制性TME的逆轉(zhuǎn)方案僅限于使用抑制劑或靶向分子，但這些方案通常僅針對特定免疫逃逸相關(guān)因子，而TME對NK細胞的影響是普遍的，因此效果欠佳。迄今為止，能克服TME多重抑制作用的方案并不多，更遑論同時實現(xiàn)TME抑制解除與NK細胞激活的雙重目標。 本研究通過賦予NK細胞植物化學特性，實現(xiàn)了對實體瘤的有效免疫治療。通過膜融合技術(shù)，用天然類囊體(Tk)膜修飾NK細胞，構(gòu)建出植物化學修飾的NK細胞(PC-NKs)。這種Tk工程化處理能顯著激活NK細胞，Tk膜上的抗氧化酶可抑制糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)，進而提升NK細胞中激活受體和細胞毒性效應(yīng)分子的表達水平。系統(tǒng)性給藥后，PC-NKs細胞能精準靶向腫瘤組織，并借助Tk膜上的過氧化氫酶深度重編程TME，從而顯著增強直接殺傷能力并激活免疫性TME。該方案在實現(xiàn)顯著治療效果的同時幾乎不引發(fā)異常反應(yīng)，直接殺傷作用與強免疫調(diào)節(jié)的協(xié)同效應(yīng)產(chǎn)生了強大的抗癌效果，為開發(fā)針對實體瘤的高效NK細胞療法提供了新思路。
實驗結(jié)果
通過膜融合技術(shù)，成功將Tk膜與NK細胞融合，形成PC-NKs細胞。該融合過程不影響NK細胞的活性和增殖能力，Tk組分被完整轉(zhuǎn)移至NK細胞，從而賦予NK細胞類囊體植物化學功能。
Tk膜上的抗氧化酶通過分解細胞內(nèi)ROS，誘導GSK-3β抑制，進而上調(diào)NF-κB和p-eIF2B水平，最終實現(xiàn)PC-NKs細胞的顯著活化。Tk工程有效促進了NK細胞激活受體的表達，特別是核心受體NKG2D，同時降低了抑制性受體NKG2A的表達。NKG2D表達提升促進了NK細胞與腫瘤細胞的特異性結(jié)合，進而誘導靜息態(tài)NK細胞中溶解顆粒的極化，并刺激促炎細胞因子分泌。受體表達水平與細胞毒性效應(yīng)分子分泌的同步顯著增強，共同證實了Tk對NK細胞的有效激活作用。因此，PC-NKs細胞對腫瘤細胞展現(xiàn)出比天然NK細胞更強的細胞毒性。
除了直接殺傷腫瘤細胞外，NK細胞在協(xié)調(diào)和啟動抗癌適應(yīng)性免疫反應(yīng)中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。高活性的PC-NKs細胞能產(chǎn)生多種免疫調(diào)節(jié)相關(guān)分子，DNAM-1、FLT3L和CCL5這些關(guān)鍵配體不僅能將樹突狀細胞(DCs)募集至TME并促進其成熟，增強成熟DC激活T細胞的能力。同時還能通過受體-配體相互作用誘導巨噬細胞極化，將M2型巨噬細胞重編程為M1型表型，被PC-NKs細胞處理后的M2型巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬率顯著上升。除了通過吞噬作用直接殺傷腫瘤細胞外，M1型巨噬細胞還能有效產(chǎn)生H?O?，這有利于PC-NKs細胞誘導的TME氧合作用，證實了PC-NKs細胞顯著的免疫調(diào)節(jié)能力。
由于過氧化氫酶作用，腫瘤細胞和TME中大量存在的H?O?會被PC-NKs細胞高效氧化，從而實現(xiàn)H?O?濃度下降與O?含量上升的同步效應(yīng)。H?O?分解與缺氧緩解對過繼性NK治療具有特殊意義。一方面，高濃度的H?O?易影響NKs的活性與功能。通過Tk膜上的過氧化氫酶作用，對NK細胞進行工程化改造，能在高H?O?水平環(huán)境中有效提升其活性，從而使PC-NKs細胞在實體瘤中的抗腫瘤性能顯著增強。另一方面，腫瘤組織中的缺氧環(huán)境會誘導腫瘤細胞表面NKG2D的特異性配體MIC分子脫落，從而促進其對免疫監(jiān)視的抵抗。PC-NKs細胞上NKG2D表達量的增加以及腫瘤細胞上MICA分子的表達，使得PC-NKs細胞與腫瘤細胞之間能夠形成有效的受體-配體結(jié)合，這是NK細胞介導的腫瘤細胞殺傷作用所必需的條件。此外，PC-NKs細胞表現(xiàn)出更強的腫瘤聚集性和明顯更慢的清除速率，證實了其更具活性的腫瘤靶向與識別能力。
5.PC-NKs細胞顯著的體內(nèi)抗腫瘤效果PC-NKs細胞治療組表現(xiàn)出更強的腫瘤細胞凋亡誘導效應(yīng)和更低的腫瘤細胞增殖活性，腫瘤抑制率顯著升高，腫瘤生長顯著延緩，腫瘤組織中更多癌細胞出現(xiàn)結(jié)構(gòu)改變或死亡，腫瘤重量和體積顯著降低，小鼠生存期顯著延長，并且未觀察到肺轉(zhuǎn)移跡象，轉(zhuǎn)移指數(shù)與分級結(jié)果進一步證實PC-NKs細胞治療顯著減輕了肺轉(zhuǎn)移負荷，驗證了PC-NKs療法相較于傳統(tǒng)過繼性NK療法的抗腫瘤性能。此外，PC-NKs細胞治療組小鼠的主要器官未出現(xiàn)明顯損傷，體重和血液生化指標均無異常，驗證了該療法作為癌癥治療手段的安全性。PC-NKs細胞的浸潤能力顯著增強，這可能源于其高度活化和改善的腫瘤富集特性。PC-NKs細胞浸潤的增加顯著促進了DC細胞的成熟，增強成熟DC激活T細胞的能力。除免疫細胞外，免疫刺激細胞因子也是評估免疫反應(yīng)的重要指標，PC-NKs細胞治療組能誘導高水平的TNF-α和IFN-γ分泌，同時產(chǎn)生低量的TGF-β。這些數(shù)據(jù)共同證明，在荷瘤小鼠模型中，PC-NKs療法比單一NK療法具有更強的免疫刺激能力，從而產(chǎn)生更優(yōu)異的抗腫瘤治療效果。
PC-NKs細胞治療組中能夠進行主要組織相容性復合體(MHC)I類分子介導的交叉呈遞(CD11c+MHCI+ DCs)的成熟DCs比例更高，促進了具有優(yōu)異克隆多樣性和細胞毒活性的T細胞增殖。因此，PC-NKs細胞治療能夠促進建立有效的免疫記憶效應(yīng)，這對于良好的癌癥預后至關(guān)重要。
討論
通過膜融合方式用囊泡修飾NK細胞，在保持NK細胞活力和增殖能力的同時，通過抗氧化酶激活的ROS-GSK3β–NF–κB/eIF2B信號通路顯著增強了其活性。實驗結(jié)果表明，激活配體NKG2D與細胞毒性效應(yīng)分子的表達顯著提升，NK細胞的抗腫瘤細胞毒性明顯增強。經(jīng)系統(tǒng)性給藥后，高度活化的PC-NKs細胞高效富集于腫瘤組織，在分解H?O?的同時改善TME的缺氧狀態(tài)。這使腫瘤細胞表面配體MICA的表達水平大幅上升，進而強化了NK細胞與腫瘤細胞的結(jié)合體形成，顯著提升了腫瘤殺傷能力。此外，PC-NKs細胞能有效重編程針對腫瘤的免疫應(yīng)答，使細胞毒性免疫細胞及細胞因子得到明顯改善。直接殺傷作用與多重免疫調(diào)節(jié)功能的協(xié)同效應(yīng)，在實體瘤治療中展現(xiàn)出令人振奮的抗癌效果。顯然，將Tk植物活性成分轉(zhuǎn)移至NK細胞，極大提升了其在實體瘤治療中的表現(xiàn)。該策略還具有快速、簡便、無需基因改造等特點，可推廣至其他基于細胞的療法。 T細胞與TME中的ROS廣泛參與T細胞的失活、凋亡及功能抑制，因此，用Tk對T細胞進行工程化改造，也將成為提升T細胞腫瘤免疫應(yīng)答和治療效能的潛力策略。同理，只要其他淋巴細胞活性受ROS和缺氧影響，理論上均可通過Tk膜融合技術(shù)提升其活性。下一代PC-NKs產(chǎn)品可通過工程化改造分泌游離因子或呈遞膜結(jié)合受體，從而增強體內(nèi)增殖與持久性、腫瘤歸巢及浸潤能力，并進一步提升NK細胞的殺傷效力。
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