一、背景

倉鼠腎成纖維細(xì)胞是一種來源于倉鼠腎臟的成纖維細(xì)胞系。這些細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力和良好的細(xì)胞形態(tài)，廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中。

倉鼠腎成纖維細(xì)胞可以用于研究腎臟疾病的發(fā)生機(jī)制、藥物篩選和毒性評價等。例如，可以通過細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，觀察不同藥物對細(xì)胞增殖、凋亡、代謝等方面的影響，從而評估藥物的療效和安全性。

此外，倉鼠腎成纖維細(xì)胞還可以用于研究腎臟疾病的分子機(jī)制和信號通路。通過基因表達(dá)分析、蛋白質(zhì)組學(xué)研究等技術(shù)手段，可以深入了解腎臟疾病的發(fā)生和發(fā)展過程，為疾病的診斷和治療提供重要的理論基礎(chǔ)。

二、倉鼠腎成纖維細(xì)胞培養(yǎng)操作

1)復(fù)蘇倉鼠腎成纖維細(xì)胞：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。

將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2)倉鼠腎成纖維細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3)倉鼠腎成纖維細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。

下面T25瓶為例；

a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。

b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

三、應(yīng)用

倉鼠腎成纖維細(xì)胞可以用于鴨坦布蘇病毒誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的機(jī)制研究：

細(xì)胞自噬是一種在真核生物中高度保守的細(xì)胞內(nèi)分解代謝途徑,可去除衰老、聚集、未折疊的蛋白質(zhì)和受損的細(xì)胞器。同時,大量研究證實(shí),細(xì)胞自噬在病毒感染中也發(fā)揮重要作用,可以調(diào)控病毒的復(fù)制和宿主免疫反應(yīng),從而影響病毒的致病性。除了DTMUV外,黃病毒屬還包括多種人畜共患病病毒,例如西尼羅河病毒(West Nile virus,WNV)、日本乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)、登革病毒(Dengue virus,DENV)和寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)等。報道表明,細(xì)胞自噬在多種黃病毒的感染和復(fù)制中起著重要作用,但DTMUV與細(xì)胞自噬之間的具體相互作用尚不清楚。因此,本研究分析了DTMUV與自噬間的相互關(guān)系、DTMUV的編碼蛋白對自噬的影響,以及DTMUV及其重要功能蛋白誘導(dǎo)自噬的相關(guān)信號通路。

研究結(jié)果表明,DTMUV感染鴨胚成纖維細(xì)胞(Duck embryo fibroblasts,DEF)和倉鼠腎成纖維細(xì)胞后能顯著誘導(dǎo)LC3-II的表達(dá),引起細(xì)胞自噬,使用自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)和自噬抑制劑3-MA(3-Methyladenine)分別處理細(xì)胞后感染DTMUV,發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)自噬能促進(jìn)病毒復(fù)制,而抑制自噬則顯著降低了病毒的復(fù)制。為確定DTMUV誘導(dǎo)自噬的主要功能蛋白,將DTMUV的3種結(jié)構(gòu)蛋白(衣殼蛋白C、膜蛋白M、囊膜蛋白E)和7種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)轉(zhuǎn)染DEF細(xì)胞。

結(jié)果表明,DTMUV非結(jié)構(gòu)蛋白NS3能誘導(dǎo)細(xì)胞自噬,又通過Western blot、免疫熒光和透射電鏡觀察等方法,驗(yàn)證了NS3蛋白對自噬的誘導(dǎo)且發(fā)現(xiàn)其能誘導(dǎo)完整的自噬流。

此外,為進(jìn)一步明確NS3蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的信號通路,使用細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶2(Extracellular regulated protein kinases 2,ERK2)的特異性抑制劑U0126和si RNA抑制ERK2介導(dǎo)的信號通路后,發(fā)現(xiàn)NS3蛋白誘導(dǎo)的自噬水平降低,說明ERK2參與NS3蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬。最后,通過抑制NS3誘導(dǎo)的自噬,與對照組相比DTMUV復(fù)制和滴度降低,說明NS3誘導(dǎo)的自噬同樣可以促進(jìn)DTMUV的復(fù)制。

綜上所述,DTMUV感染DEF細(xì)胞可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬,且NS3蛋白能通過ERK2信號通路誘導(dǎo)自噬,誘導(dǎo)的自噬能促進(jìn)病毒復(fù)制。以上研究結(jié)果為進(jìn)一步研究DTMUV與自噬的相互關(guān)系奠定了基礎(chǔ),同時也加深了對DTMUV分子致病機(jī)制的理解。

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