一、背景

放線共生放線桿菌PCR試劑盒是一種用于檢測放線共生放線桿菌的分子生物學(xué)試劑。該試劑盒通常包含用于擴(kuò)增特定DNA片段的引物、DNA聚合酶以及其他的必需試劑，能夠在PCR儀中運(yùn)行，對特定的DNA序列進(jìn)行快速、靈敏的檢測。

二、放線共生放線桿菌PCR試劑盒實(shí)驗(yàn)操作

1、放線共生放線桿菌PCR試劑盒模板制備（樣本制備區(qū)）

建議使用配套水生動物病害基因組DNA/RNA提取試劑盒系列產(chǎn)品，具體過程詳見產(chǎn)品說明書。

2、添加模板（模板添加區(qū)，放置于冰盒中進(jìn)行）

請于-20℃條件下保存，有效期12個(gè)月

取出所需測試數(shù)的已含有反應(yīng)液A-TSV-I的PCR管，將試劑解凍，離心30秒，在管蓋上標(biāo)記管名（陰性對照管NG、樣品XX、陽性對照管PG）。打開管蓋向各管管底分別加入0.8μL B-I及0.2μL R-I，蓋上陰性對照管管蓋，其他各管分別沿管壁加入2μL模板，順序?yàn)榇郎y樣品模板、PG-TSV-I，依次蓋好各管管蓋，離心30秒，立即進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。

3、放線共生放線桿菌PCR試劑盒擴(kuò)增反應(yīng)（擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)）

①恒溫儀器63℃條件下反應(yīng)60 min。待儀器升溫至63℃后，新建程序，設(shè)置實(shí)驗(yàn)名稱及反應(yīng)時(shí)間，將步驟2中離心后的PCR反應(yīng)管放入恒溫?zé)晒夥肿訖z測儀，點(diǎn)擊開始檢測。

②若使用熒光定量PCR儀，則熒光基團(tuán)選擇FAM，淬滅基團(tuán)選擇None，將63℃15 s，63℃45 s作為一個(gè)循環(huán)，于63℃45 s處收集熒光信號，60個(gè)循環(huán)。

其他儀器請參照儀器說明書進(jìn)行設(shè)置。

4、設(shè)置qPCR反應(yīng)（20μL體系，在樣品制備室進(jìn)行）

如果只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對照，6個(gè)用于PCR陽性對照。如果做2-3次重復(fù)，則反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加2或3倍。

5、數(shù)據(jù)處理

如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。

三、應(yīng)用

放線共生放線桿菌PCR試劑盒可以用于牙周病原菌在牙周病人齦下菌斑中的分布研究：

牙周病原菌在牙周病人銀下菌斑中的分布研究目的應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分別檢測牙周病人釀下菌斑中的10種牙周病原菌，觀察其分布特點(diǎn)，并初步分析不同的細(xì)菌組合與牙周病的關(guān)系。

材料與方法：使用放線共生放線桿菌PCR試劑盒將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增出牙釀葉琳菌部分165 rRNA基因片段的實(shí)驗(yàn)方法推廣致更多的牙周病病原菌。根據(jù)各自特異區(qū)的165 rRNA基因(165 rDNA)序列，分別合成10種牙周病病原菌:牙跟葉琳菌(Pg)，福塞類桿菌(Bf)，中間型普里沃菌(Pi)，齒垢密螺旋體(Td)，變黑普里沃菌(Pn)，直型彎曲桿菌(Cr)，溶蝕艾肯菌(Ec)，放線共生放線桿菌(Aa)，黃褐二氧化碳噬纖維菌(C。)，生痰二氧化碳噬纖維菌(CS)的特異引物，然后隨機(jī)選擇62位患者，其中牙周健康者16例，慢性邊緣性牙跟炎患者17例，慢性牙周炎患者29例，每例選兩個(gè)位點(diǎn)，分別取兩份跟下菌斑標(biāo)本，共124份樣本。

同時(shí)記錄各病例的一般情況：年齡，性別，吸煙情況和各項(xiàng)臨床指標(biāo):探查袋深，探診出血情況等，牙周炎患者同時(shí)記錄附著水平。提取菌斑中的DNA，分別用10對特異引物，TaqDNA聚合酶等以及放線共生放線桿菌PCR試劑盒在適宜的條件和溫度下進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物在加入0.sug/m1澳化已錠(EB)的1.50rk瓊脂糖凝膠中電泳，紫外透射儀下進(jìn)行觀察，采用DLZ000 DNA marker記錄電泳DNA片段大小，檢測是否出現(xiàn)與特異引物相對應(yīng)的特異擴(kuò)增帶，以鑒定細(xì)菌種類。用統(tǒng)計(jì)軟件分析細(xì)菌與病例一般情況與各項(xiàng)臨床指標(biāo)的關(guān)系。

結(jié)果：10種牙軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院碩士學(xué)位論文周病病原菌在各組中都有檢出，其中跟炎組牙跟葉琳菌(Pg)，中間型普里沃菌(pi)和齒垢密螺旋體(Td)的檢出率高于健康組;牙周病組牙齲葉琳菌(Pg)，福塞類桿菌(Bf)，中間型普里沃菌(Pi)，齒垢密螺旋體(Td)，變黑普里沃菌(Pn)和黃褐二氧化碳噬纖維菌(Co)的檢出率高于健康組;牙周病組的中間型普里沃菌(Pi)，齒垢密螺旋體(Td)和變黑普里沃菌(Pn)高于齲炎組。

隨年齡增大，齒垢密螺旋體(Td)的檢出率增加;女性齲下菌斑中的牙跟葉琳菌(Pg)檢出率多于男性;不吸煙者患者中檢出較多的牙齲葉琳菌(Pg)。中間型普里沃菌(Pi)、齒垢密螺旋體(Td)和變黑普里沃菌(Pn)與牙周病關(guān)系更為密切。

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