一、背景

血液增菌培養(yǎng)基用于血液、胸、腹水等無菌液體標本需氧菌的增菌實驗時使用，滿足各種需氧菌的培養(yǎng)需求。

原理：該培養(yǎng)基營養(yǎng)成分豐富，加入指示劑，在無菌的情況下顯紅色，有菌生長的情況下為黃色，如有產(chǎn)鹼細菌生長顯深紅色。

成分(g/L)：蛋白胨10.0；牛肉浸出粉3.0；氯化鈉5.0；葡萄糖3.0；枸櫞酸鈉3.0；對氨基苯甲酸0.05；硫酸鎂2.4；酚紅0.024；pH值7.4±0.1，25℃。

用法：稱取本品26.5g,加熱溶解于1000ml蒸餾水中,分裝每瓶50-100ml,121℃高壓滅菌15分鐘,備用。

二、實驗方法

1、集標本和接種

接種前仔細檢查培養(yǎng)瓶內(nèi)是否被污染（由紅變黃）。黑色血紅蛋白顆粒屬正常。

打開瓶上的鋁蓋進行嚴格消毒，無菌采集標本5-10ml，直接用針頭穿入橡膠塞中心部位入瓶內(nèi)，加入標本（不可將注射器中空氣注入瓶內(nèi)），取出針頭再次消毒瓶塞。

輕搖培養(yǎng)瓶使液體充分混勻。然后在瓶上寫好病人的姓名、接種日期等。

2、培養(yǎng)

將培養(yǎng)瓶放入35-37度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

以后每天取出觀察，看瓶中液體是否變色。

3、結(jié)果判讀

一周內(nèi)任何時間發(fā)現(xiàn)有培養(yǎng)基變色；血液層上有絮狀沉淀；血液層表面或深層有白色顆粒；液體培養(yǎng)基凝固等細菌生長跡象，應(yīng)立即做菌種的分離鑒定及初步藥敏分析。

三、應(yīng)用

用于動物性食品中四種致病菌多重PCR快速檢測方法研究：

目前對食品中致病菌檢測的方法以微生物常規(guī)培養(yǎng)法為主,需要37天,操作繁瑣,所用試劑復(fù)雜多樣,費用很高,不能滿足實際商品流通需要。PCR（聚合酶鏈式反應(yīng)）技術(shù)具有特異性強、靈敏度高、操作簡單、快速的特點,使用PCR技術(shù)檢測食品中致病菌的研究方興未艾。大腸埃希氏菌O157:H7、單核細胞增生李斯特氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌和熒光假單胞菌是污染動物性食品的四種重要的致病菌。

結(jié)合通用前增菌技術(shù)研究,建立了一種多重PCR檢測新方法,可以在LB培養(yǎng)基通用增菌后的6h內(nèi)一步同時檢測食品中污染的這四種致病菌。該方法具有特異性良好、簡便快速、經(jīng)濟實用的優(yōu)點。研究結(jié)果如下:（1）對大腸埃希氏菌O157:H7、副溶血性弧菌、傷寒沙門氏菌、宋氏志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、創(chuàng)傷弧菌、單增李氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、熒光假單胞菌等九種食源性致病菌進行通用前增菌方法研究,實驗表明,在LB肉湯培養(yǎng)基36℃培養(yǎng)18 h,增菌,且增菌數(shù)量級均衡一致,達108 cfu/mL。

（2） LB、NB和UPB培養(yǎng)基中30℃、33℃、36℃培養(yǎng)12h,大腸埃希氏菌O157:H7、副溶血性弧菌、傷寒沙門氏菌、宋氏志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、創(chuàng)傷弧菌、單增李氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、熒光假單胞菌等九種菌增菌數(shù)量級達到106以上,也能夠滿足PCR等檢測方法的需要。但這幾種培養(yǎng)基在36℃的培養(yǎng)時間應(yīng)選在1218 h左右,不宜超過18 h。

（3） 根據(jù)大腸埃希氏菌O157:H7的eaeA基因,單核細胞增生李斯特氏菌的hly基因,小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的ail基因,熒光假單胞菌的htpX基因設(shè)計了4對引物。實驗證實具有良好的特異性。

（4）建立了大腸埃希氏菌O157:H7、單核細胞增生李斯特氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌和熒光假單胞菌的單重和多重PCR檢測方法,并確定了多重PCR體系和熱循環(huán)參數(shù)。經(jīng)實驗證實了所建立的方法特異性很強。

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