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BCA 蛋白定量試劑盒：蛋白質濃度測定的可靠方法

來源：上海易匯生物科技有限公司 2025年07月13日 11:06

在生命科學研究領域，準確測定蛋白質濃度是蛋白質組學研究、Western Blot酶活性分析等眾多實驗的基礎。BCA（Bicinchoninic Acid）蛋白定量試劑盒作為一種經(jīng)典且廣泛應用的蛋白定量工具，憑借其基于雙縮脲反應的原理和良好性能，為科研人員提供了可靠的蛋白質濃度測定方案。

一、核心原理與試劑組成

（一）定量原理

BCA 蛋白定量試劑盒的原理基于雙縮脲反應與 BCA 對銅離子的特異性顯色反應。在堿性條件下，蛋白質分子中的肽鍵與二價銅離子（Cu2?）發(fā)生雙縮脲反應，使 Cu2?被蛋白質中的肽鍵還原為一價銅離子（Cu?）。生成的 Cu?與 BCA 試劑結合，形成紫色絡合物，該絡合物在 562 nm 處有強烈的吸收峰，且其吸光度值與蛋白質濃度在一定范圍內(nèi)呈良好的線性關系。通過測定樣品溶液在 562 nm 處的吸光度，并與已知濃度的蛋白質標準品建立的標準曲線對比，即可準確計算出待測樣品的蛋白質濃度。

（二）試劑組成

A 液：主要成分是 BCA，還包含碳酸鈉、碳酸氫鈉、酒石酸鈉等緩沖物質，以及氫氧化鈉調節(jié) pH 值，使溶液呈堿性環(huán)境，為雙縮脲反應和 BCA 顯色反應提供適宜條件。其中，酒石酸鈉能夠穩(wěn)定 Cu2?，防止其在堿性條件下形成沉淀，保證反應的順利進行。

B 液：為硫酸銅溶液，提供反應所需的 Cu2? 。在使用時，需將 A 液和 B 液按照 50:1 的比例混合，配制成 BCA 工作液?；旌虾蟮墓ぷ饕褐?，BCA 與 Cu2?形成 BCA - Cu2?復合物，該復合物與蛋白質反應后生成紫色絡合物，用于后續(xù)的吸光度測定。

蛋白質標準品：通常為已知濃度的牛血清白蛋白（BSA）溶液，作為定量的參照標準。不同濃度的蛋白質標準品用于繪制標準曲線，常見的標準品濃度梯度包括 0 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL、600 μg/mL、800 μg/mL、1000 μg/mL 等，科研人員可根據(jù)實際需求進行選擇和稀釋。

二、產(chǎn)品性能優(yōu)勢

（一）高靈敏度與準確性

BCA 蛋白定量試劑盒對蛋白質具有較高的檢測靈敏度，能夠檢測到低至 20 μg/mL 的蛋白質濃度。其基于比色法的定量原理，通過標準曲線建立蛋白質濃度與吸光度的線性關系，結合精密的分光光度計檢測，可實現(xiàn)對蛋白質濃度的準確測定。在實際應用中，該試劑盒的測量誤差較小，多次重復實驗結果的變異系數(shù)（CV）通常控制在 5% 以內(nèi)，能夠滿足科研實驗對蛋白質濃度準確性的要求。

（二）良好的兼容性

該試劑盒與多種蛋白質樣本類型兼容，無論是細胞裂解液、組織勻漿、血清、血漿，還是純化后的蛋白質溶液，均可使用 BCA 法進行定量。同時，BCA 蛋白定量對去污劑具有一定耐受性，常見的 Triton X - 100、SDS 等去污劑在較低濃度下（如 Triton X - 100≤0.1%，SDS≤0.05%），不會對定量結果產(chǎn)生顯著影響，方便科研人員對含有去污劑的蛋白質樣本進行直接測定。但需注意，過高濃度的去污劑或某些強還原劑（如 DTT、β - 巰基乙醇）可能會干擾反應，需進行適當?shù)臉颖绢A處理或優(yōu)化實驗條件。

（三）穩(wěn)定性與便捷性

BCA 試劑在儲存和使用過程中表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。A 液和 B 液在常溫避光條件下可長期保存，混合后的 BCA 工作液在室溫下數(shù)小時內(nèi)仍能保持穩(wěn)定的顯色性能，可滿足常規(guī)實驗的使用需求。操作流程相對簡便，只需將樣本、標準品與 BCA 工作液混合，孵育一定時間（通常 37℃孵育 30 分鐘或室溫孵育 2 小時）后，即可進行吸光度測定，無需復雜的分離和純化步驟，適合大規(guī)模樣本的快速定量。

（四）寬線性范圍

BCA 蛋白定量試劑盒具有較寬的線性范圍，一般可在 20 - 2000 μg/mL 的蛋白質濃度區(qū)間內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關系 ?？蒲腥藛T可根據(jù)樣本中蛋白質濃度的預估范圍，選擇合適的稀釋倍數(shù)，使樣本的吸光度值處于標準曲線的線性范圍內(nèi)，確保定量結果的準確性和可靠性。對于蛋白質濃度過高或過低的樣本，通過適當稀釋或濃縮處理，也能實現(xiàn)準確的定量分析。

三、實驗應用與操作要點

（一）標準曲線繪制

稀釋蛋白質標準品：將蛋白質標準品（如牛血清白蛋白）按照預設的濃度梯度進行稀釋，制備不同濃度的標準品溶液。例如，取一定體積的高濃度標準品，用稀釋緩沖液（如 PBS）依次稀釋，得到 0 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL、600 μg/mL、800 μg/mL、1000 μg/mL 等濃度的標準品。

加樣與反應：在 96 孔板或比色皿中，分別加入不同濃度的標準品溶液（一般每孔或每份 20 μL），同時設置空白對照（加入等量的稀釋緩沖液替代樣本）。隨后，向各孔或比色皿中加入 200 μL BCA 工作液，輕輕振蕩混勻，使溶液充分接觸。將 96 孔板置于 37℃恒溫箱中孵育 30 分鐘，或在室溫下孵育 2 小時，使顯色反應。

吸光度測定：使用分光光度計，在 562 nm 波長處測定各標準品溶液和空白對照的吸光度值。以標準品的蛋白質濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。通常采用最小二乘法進行線性擬合，得到標準曲線的方程（y = ax + b，其中 y 為吸光度值，x 為蛋白質濃度，a 為斜率，b 為截距）。

（二）樣本測定

樣本準備：根據(jù)樣本類型和蛋白質濃度預估，對樣本進行適當稀釋。對于未知濃度的樣本，可先進行預實驗，選擇合適的稀釋倍數(shù)，確保樣本的吸光度值在標準曲線的線性范圍內(nèi) 。例如，對于細胞裂解液樣本，可先進行 10 倍稀釋，若吸光度值過高，再進一步稀釋。

加樣與反應：在 96 孔板或比色皿中加入 20 μL 稀釋后的樣本溶液，按照與標準曲線繪制相同的操作步驟，加入 200 μL BCA 工作液，振蕩混勻后進行孵育，使樣本中的蛋白質與 BCA 試劑充分反應顯色。

計算蛋白質濃度：測定樣本溶液在 562 nm 處的吸光度值，將其代入標準曲線方程，計算出樣本的蛋白質濃度。若樣本進行了稀釋，需乘以相應的稀釋倍數(shù)，得到原始樣本的蛋白質濃度。

（三）操作關鍵注意事項

試劑儲存與使用規(guī)范：嚴格按照產(chǎn)品說明書儲存 BCA 試劑，A 液和 B 液應避光保存，防止 BCA 和 Cu2?發(fā)生氧化等反應而失效。使用前將試劑平衡至室溫，BCA 工作液需現(xiàn)用現(xiàn)配，避免因放置時間過長導致顯色性能下降。在加樣過程中，使用移液器準確吸取試劑和樣本，避免因加樣誤差影響定量結果。

樣本處理細節(jié)：確保樣本充分裂解或勻漿，使蛋白質釋放到溶液中，避免因蛋白質溶解導致定量結果偏低。對于含有干擾物質（如高濃度去污劑、還原劑）的樣本，需進行適當?shù)念A處理，如透析、超濾等方法去除干擾物質，或優(yōu)化反應條件（如增加 BCA 工作液用量、延長孵育時間）。

實驗條件控制：孵育溫度和時間對顯色反應有顯著影響，需嚴格按照說明書要求進行操作。在使用 96 孔板進行實驗時，確?？變?nèi)液體分布均勻，避免因邊緣效應導致吸光度值偏差。每次實驗均需重新繪制標準曲線，以消除實驗誤差，保證定量結果的準確性。

儀器校準與維護：使用分光光度計前，需進行儀器校準，確保波長準確性和吸光度測量精度。定期對儀器進行維護和清潔，避免因儀器故障或污染影響實驗結果。

BCA 蛋白定量試劑盒憑借其科學的原理、優(yōu)良的性能和簡便的操作，成為生命科學研究中蛋白質濃度測定的重要工具?？蒲腥藛T在遵循操作規(guī)范、合理優(yōu)化實驗條件的基礎上，能夠充分發(fā)揮該試劑盒的優(yōu)勢，為蛋白質相關研究提供可靠的定量數(shù)據(jù)支持，推動生命科學領域的深入探索與發(fā)展。

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