Endothelial KDM5B Regulated by Piezo1 Contributes to Disturbed Flow Induced Atherosclerotic Plaque Formation

Keywords: atherosclerosis, disturbed flow, endothelial cells, KDM5B, Piezo1

血管系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病的發(fā)病至關(guān)重要，血管內(nèi)皮作為心血管系統(tǒng)的單細(xì)胞內(nèi)襯，直接接觸循環(huán)血液并承受壁面剪切應(yīng)力，通過響應(yīng)病理生理刺激維持血管穩(wěn)態(tài)。內(nèi)皮細(xì)胞可感知機(jī)械刺激并通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)影響細(xì)胞功能，其功能障礙會(huì)導(dǎo)致血管病變，而動(dòng)脈粥樣硬化更易發(fā)生在血流紊亂區(qū)域，因此了解紊亂血流對(duì)內(nèi)皮功能和基因表達(dá)的影響，有助于闡明斑塊形成機(jī)制。

表觀遺傳改變（包括 DNA 甲基化、組蛋白翻譯后修飾和非編碼 RNA 等）在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。研究表明，剪切應(yīng)力可通過 DNA 甲基化和組蛋白乙酰化等機(jī)制調(diào)節(jié)內(nèi)皮基因表達(dá)，其中組蛋白甲基化修飾是重要的染色質(zhì)修飾形式（如層流與 H3K27 甲基化減少相關(guān)，可增強(qiáng)內(nèi)皮抗炎基因表達(dá)），但紊亂血流對(duì)內(nèi)皮組蛋白去甲基化酶表達(dá)及組蛋白去甲基化的調(diào)控機(jī)制尚不明確，這可能是理解動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)鍵。 而KDM5B 作為組蛋白 H3K4me2/me3 去甲基化酶，參與胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生等過程，可調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥和血管生成相關(guān)的長(zhǎng)鏈非編碼 RNA，并在心臟纖維化和巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用。

鑒于此，蘇州大學(xué)唐仲英醫(yī)學(xué)研究院的研究團(tuán)隊(duì)在一項(xiàng)研究中旨在闡明d-flow 條件下調(diào)節(jié)內(nèi)皮 KDM5B 表達(dá)的機(jī)制，并探討 KDM5B 對(duì)小鼠動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn) d-flow 誘導(dǎo)的內(nèi)皮 KDM5B 表達(dá)受 Piezo1 調(diào)節(jié)，KDM5B 可能通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化。研究結(jié)果發(fā)表在Journal of cellular and molecular medicine期刊題為“Endothelial KDM5B Regulated by Piezo1 Contributes to Disturbed Flow Induced Atherosclerotic Plaque Formation”。

首先，為繪制響應(yīng)致動(dòng)脈粥樣硬化紊亂血流（d-flow）刺激的內(nèi)皮組蛋白去甲基化酶表達(dá)譜,對(duì)PCL 小鼠模型的 scRNA-seq 進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞存在異質(zhì)性，非 PCL 頸動(dòng)脈中主要為 EC1、EC2 和 EC3 亞群，而 PCL 手術(shù)組出現(xiàn)新亞群 EC4 和 EC5（圖 1A）。其中組蛋白賴氨酸去甲基化酶 KDM5 家族成員 KDM5B 在 d-flow 刺激的 EC4 亞群中選擇性上調(diào)，而在其他 EC 亞群中未見上調(diào)（圖 1B ），該結(jié)果通過 Kdm5b mRNA 表達(dá)（圖 1C）和 KDM5B 免疫染色（圖 1D） 得以證實(shí)。同時(shí)，在 d-flow 和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊易發(fā)的主動(dòng)脈弓區(qū)域，Kdm5b mRNA 水平較降主動(dòng)脈顯著上調(diào)（圖 1E）。體外實(shí)驗(yàn)借助錐板裝置對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞施加層流或振蕩流刺激 24 小時(shí)后發(fā)現(xiàn)，振蕩流刺激的細(xì)胞中 KDM5B 的 mRNA 和蛋白水平顯著高于層流刺激的細(xì)胞（圖1F,G）。

圖 1 組蛋白去甲基化酶 KDM5B 在紊亂血流條件下的血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)。

然后，為探究紊亂血流如何誘導(dǎo)內(nèi)皮 KDM5B 表達(dá)，篩選了 shKdm5b HUVEC 中差異表達(dá)的機(jī)械傳感器，并分析了 PCL 術(shù)后左頸動(dòng)脈（LCA）的 scRNA-seq 數(shù)據(jù)集。發(fā)現(xiàn)傳感器 Piezo1 主要表達(dá)于與紊亂血流相關(guān)的 EC4 和 EC5 亞群（圖 2A），且 PCL 術(shù)后左頸動(dòng)脈及主動(dòng)脈弓中的 Piezo1 mRNA 水平較血流保護(hù)區(qū)域顯著上調(diào)（圖 2B,C）。體外實(shí)驗(yàn)顯示，與靜態(tài)培養(yǎng)的 HUVEC 相比，層流和紊亂血流刺激均能上調(diào) Piezo1 mRNA 表達(dá)及 Ca2?內(nèi)流（圖 2D,E）。通過基因和藥理學(xué)方法進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，敲低 Piezo1 可降低頸動(dòng)脈內(nèi)皮 KDM5B 表達(dá)（圖 2F,G），而 Piezo1 激動(dòng)劑 Yoda1 處理 HUVEC 可增加 KDM5B 表達(dá)，該作用可被阻斷肽 GsMTx4 抑制（圖 2H,I），證實(shí) Piezo1 在紊亂血流條件下可通過調(diào)控鈣信號(hào)促進(jìn)內(nèi)皮 KDM5B 表達(dá)。

圖 2 Piezo1 在紊亂血流條件下促進(jìn)內(nèi)皮 KDM5B 的表達(dá)。

接下來(lái)，為了探究 Piezo1 如何調(diào)節(jié)紊亂血流（d-flow）誘導(dǎo)的 KDM5B 表達(dá)，研究人員首先通過 scRNA-seq 分析篩選出 PCL 手術(shù) 7 天后頸動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中響應(yīng)機(jī)械刺激的關(guān)鍵基因。經(jīng) GO 分析發(fā)現(xiàn) 12 個(gè)基因在 “機(jī)械刺激響應(yīng)” 類別中顯著富集（圖 3A ）。隨后利用生物信息學(xué)工具預(yù)測(cè) KDM5B 轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)現(xiàn) 44 個(gè)預(yù)測(cè)因子中 ETS1 和 c-JUN 與機(jī)械刺激響應(yīng)基因重疊（圖 3B、C ）。進(jìn)一步通過免疫染色實(shí)驗(yàn)證實(shí)，PCL 手術(shù)的左側(cè)頸動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中 ETS1 和磷酸化 c-JUN 水平高于未手術(shù)的右側(cè)頸動(dòng)脈（圖 3D、E），且暴露于振蕩切應(yīng)力的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中這兩種分子的表達(dá)水平也顯著高于層流切應(yīng)力條件下的細(xì)胞（圖 3F、G）。這些結(jié)果表明，Piezo1 可能通過 ETS1 和 c-JUN 介導(dǎo)，在紊亂血流條件下調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞中 KDM5B 的表達(dá)。

為確定 Kdm5b 是否為 ETS1 和 c-JUN 的靶基因，利用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)在 HEK293T 細(xì)胞檢測(cè)ETS1 和 c-JUN 與 Kdm5b 啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合情況。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染 ETS1 或 c-JUN 質(zhì)粒后，含 Kdm5b 啟動(dòng)子區(qū)域的報(bào)告基因熒光素酶活性高于轉(zhuǎn)染載體對(duì)照的情況（圖 3H,I）表明 Kdm5b 是二者的靶基因。隨后，測(cè)定了 Piezo1 信號(hào)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞中 ETS1 表達(dá)和 c-JUN 激活的影響。結(jié)果顯示， 通過 Yoda1 激活 Piezo1 后，內(nèi)皮細(xì)胞中 ETS1 表達(dá)上調(diào)且 c-JUN 發(fā)生磷酸化，而 Piezo1 抑制劑 GsMTx4 可逆轉(zhuǎn)這一效應(yīng)（圖 3J,K）。使用 ETS1 抑制劑 TK216 或 c-JUN 抑制劑 SP600125，可顯著降低 Yoda1 誘導(dǎo)的 KDM5B 表達(dá)（圖 3L）。綜上表明，Piezo1 激活后通過誘導(dǎo) ETS1 和 c-JUN 與 Kdm5b 啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，從而增強(qiáng)紊亂血流刺激的內(nèi)皮細(xì)胞中 KDM5B 的表達(dá)。

圖 3  Piezo1 通過 ETS1 和 c-JUN 上調(diào) KDM5B 的表達(dá)。

鑒于 KDM5 亞家族成員作為 H3K4 去甲基化酶可催化 H3K4me3 去甲基化，檢測(cè) PCL 手術(shù) 7 天后頸動(dòng)脈中 H3K4me3的 修飾情況，發(fā)現(xiàn)紊亂血流下內(nèi)皮細(xì)胞 H3K4me3 水平降低（圖 4A）。同時(shí)，主動(dòng)脈弓內(nèi)皮細(xì)胞的 H3K4me3 水平顯著低于降主動(dòng)脈（圖 4B）。且體外實(shí)驗(yàn)中暴露于振蕩切應(yīng)力的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 H3K4me3 水平也低于層流切應(yīng)力條件下的細(xì)胞（圖 4C）。這些結(jié)果表明，紊亂血流可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞中 H3K4me3 去甲基化。

接下來(lái)，對(duì) KDM5B 和 Piezo1 在紊亂血流誘導(dǎo)的內(nèi)皮組蛋白 H3K4me3 去甲基化中的作用。進(jìn)行了研究。通過藥物抑制與基因敲低實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Piezo1 抑制劑 GsMTx4 可減少 Yoda1 誘導(dǎo)的 H3K4me3 去甲基化（圖 4D），Piezo1 敲低能保護(hù)小鼠頸動(dòng)脈免受紊亂血流所致的 H3K4me3 去甲基化（圖 4E）。利用慢病毒載體 shKdm5b 敲低 KDM5B 表達(dá)后，小鼠頸動(dòng)脈在紊亂血流下的 H3K4me3 去甲基化被抑制（圖 4F），且口服 KDM5B/C 特異性抑制劑 KDM5‐IN‐1 也可阻斷內(nèi)皮細(xì)胞中該去甲基化過程（圖 4G）。綜上表明，機(jī)械傳感器 Piezo1 通過調(diào)控 KDM5B 表達(dá)，使 Piezo1‐KDM5B 軸參與介導(dǎo)紊亂血流誘導(dǎo)的內(nèi)皮組蛋白 H3K4me3 去甲基化過程。

圖4  Piezo1-KDM5B 軸參與紊亂血流誘導(dǎo)的內(nèi)皮組蛋白 H3K4me3 去甲基化。

最后，為研究 KDM5B 在內(nèi)皮細(xì)胞中的作用，通過轉(zhuǎn)導(dǎo)表達(dá)人源 shKdm5b 的慢病毒載體，構(gòu)建了 Kdm5b 敲低的HUVECs，并通過定量 PCR 和免疫印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了結(jié)果（圖 5A）。 差異表達(dá)基因的 KEGG 信號(hào)通路分析顯示，在“脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化”“流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化” 和 “NF-κB 信號(hào)通路” 中顯著富集（圖 5B），這表明內(nèi)皮細(xì)胞中的 KDM5B 參與了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。 KDM5B 敲低可顯著抑制 NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)的促炎基因（如 VCAM-1、ICAM-1）表達(dá)（圖 5C-F），減少 TNF-α 誘導(dǎo)的 THP-1 細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附（圖 5G），進(jìn)而抑制內(nèi)皮炎癥反應(yīng)。這些結(jié)果表明，KDM5B 可能通過影響內(nèi)皮炎癥參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證了內(nèi)皮 KDM5B 在紊亂血流誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成中的作用，通過動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究。在 ApoE?/?小鼠中，敲低頸動(dòng)脈 Kdm5b 基因可使動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積減少 41.45%，表明 KDM5B 缺失能抑制紊亂血流誘導(dǎo)的斑塊形成。而在內(nèi)皮細(xì)胞特異性敲除 KDM5B 的 Kdm5b f/f Cdh5 cre 小鼠中，動(dòng)脈粥樣硬化病變大小較對(duì)照組減少 57.76%（圖 5H） ，直接證實(shí)內(nèi)皮 KDM5B 促進(jìn)斑塊形成。值得注意的是，血清脂質(zhì)水平和體重檢測(cè)顯示，KDM5B 缺失并未通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝或體重影響動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程。該研究結(jié)果排除了脂質(zhì)代謝因素的干擾，明確了內(nèi)皮 KDM5B 通過非脂質(zhì)依賴途徑促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的機(jī)制，為靶向 KDM5B 防治動(dòng)脈粥樣硬化提供了更直接的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

圖5  KDM5B 基因敲低可抑制內(nèi)皮炎癥并減小小鼠中紊亂血流誘導(dǎo)的頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊大小。

總之，Piezo1 作為血流機(jī)械信號(hào)的感受器，在紊亂血流刺激下通過 ETS1 和 c-JUN 轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞中 KDM5B 的表達(dá)，進(jìn)而增加組蛋白 H3K4me3 水平，促進(jìn)內(nèi)皮炎癥反應(yīng)。從功能上講，KDM5B 的缺失減少了內(nèi)皮炎癥，并減輕了紊亂血流誘導(dǎo)的頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成。

參考文獻(xiàn)：Wu L, Jiang S, Zhou X, Li W, Ke J, Liu Z, Ren L, Lu Q, Li F, Tang C, Zhu L. Endothelial KDM5B Regulated by Piezo1 Contributes to Disturbed Flow Induced Atherosclerotic Plaque Formation. J Cell Mol Med. 2024 Dec;28(23):e70237. doi: 10.1111/jcmm.70237. PMID: 39643939; PMCID: PMC11624123.

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