Mechanosensitive microRNAs - Role in Endothelial Responses to Shear Stress and Redox State

Keywords: Endothelium, Shear Stress, miR, KLF2, Oxidative Stress, Inflammation

血管內(nèi)皮細胞不僅是血液與血管壁的物理屏障，更通過抗凝、抗炎和抗氧化功能維持血管穩(wěn)態(tài)。體內(nèi)血流產(chǎn)生的切應(yīng)力是調(diào)控內(nèi)皮功能的關(guān)鍵因素：直段的脈動切應(yīng)力（PS）誘導(dǎo)抗氧化與抗炎基因表達，而彎曲分叉處的振蕩切應(yīng)力（OS）則促進促炎與氧化基因激活，這種差異導(dǎo)致動脈粥樣硬化的區(qū)域性分布，體外 PS 和 OS 模型可模擬這兩種血流模式。

微小 RNA（miR）通過形成沉默復(fù)合體降解靶 mRNA 或抑制翻譯，參與調(diào)控內(nèi)皮細胞的血管生成、血管張力等核心功能。切應(yīng)力可通過機械轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控 miR 及其宿主基因的轉(zhuǎn)錄，形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò) —— 例如，切應(yīng)力誘導(dǎo)的 miR 可調(diào)控 KLF2、KLF4 等轉(zhuǎn)錄因子，而這些因子又能反向調(diào)節(jié) miR 表達，且整個網(wǎng)絡(luò)受時間動態(tài)影響，需借助生物信息學(xué)工具解析。

基于此，加州大學(xué)里弗賽德分校醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)科學(xué)的研究團隊在Free radical biology & medicine期刊發(fā)表了題為“Mechanosensitive microRNAs - Role in Endothelial Responses to Shear Stress and Redox State”的文章。文章總結(jié)了剪切應(yīng)力調(diào)控 miRs 在內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)中的多維度作用，并探討了通過算法解析 PS 與OS 差異調(diào)控的信號網(wǎng)絡(luò)機制。

miR、KLF2 與功能性內(nèi)皮細胞

miRNA 調(diào)控的關(guān)鍵步驟在于其基因或宿主基因的轉(zhuǎn)錄起始階段，而切應(yīng)力誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子（如 KLF2）可對大量 miRNA 的表達進行調(diào)控。作為內(nèi)皮譜系的主要調(diào)節(jié)因子，KLF2 既能上調(diào) eNOS、TM、Nrf2 等發(fā)揮抗炎、抗血栓和抗氧化作用的基因，又能抑制 VCAM-1、E - 選擇素、PAI-1 和組織因子等對內(nèi)皮功能不利的基因表達。研究預(yù)測，KLF2 可轉(zhuǎn)錄調(diào)控 miR-126、miR-30a、miR-10a 等多個 miRNA。其中，miR-126 具有內(nèi)皮特異性，可增強 VEGF 信號傳導(dǎo)，且在人類中，其轉(zhuǎn)錄起始位點上游 - 1 kb 處存在假定的 KLF2 結(jié)合位點，斑馬魚研究也證實 klf2a 可通過調(diào)控 miR-126 誘導(dǎo)血流刺激的血管生成。

在許多情況下，切應(yīng)力誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子本身在轉(zhuǎn)錄水平受到調(diào)控?？箘用}粥樣硬化的 PS 可激活 MEF5/ERK5/MEF2 和 AMPK 通路，共同促進 KLF2 的轉(zhuǎn)錄上調(diào)，同時 KLF2 還可通過 HDAC5 磷酸化增加，促使 HDAC 與 MEF2 解離，進而增強 MEF2 對 KLF2 的轉(zhuǎn)錄激活；而致動脈粥樣硬化的OS 則會通過上調(diào) I 類和 II 類 HDAC 并使其核內(nèi)積累，促進 MEF2 去乙酰化，從而降低 KLF2 的轉(zhuǎn)錄激活。重要的是，KLF2 也直接受 miRNAs 的靶向調(diào)控，如 OS 可升高內(nèi)皮細胞中 miR-92a 的水平，其靶向 KLF2 和 KLF4 的 mRNA，導(dǎo)致 eNOS 等下游基因表達降低，進而引起致動脈粥樣硬化血流下的內(nèi)皮功能紊亂，除已實驗驗證的 miR-92a 外，生物信息學(xué)分析還預(yù)測了多個 miRNA 可能靶向 KLF2 mRNA，對這些 miRNA 與血流條件的相關(guān)性及內(nèi)皮細胞反應(yīng)的研究具有重要意義。

微小 RNA（miR）生物學(xué)的進展表明，血流對 KLF2 的調(diào)控發(fā)生在多個層面，包括轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后和翻譯后（圖 1）。因此，在研究 KLF2 在ECs對不同血流模式的響應(yīng)及其與內(nèi)皮細胞功能結(jié)局的關(guān)系時，應(yīng)考慮包括 miR 在內(nèi)的時間調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，而非一系列信號事件的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。

圖1    不同血流模式通過對KLF2和KLF4的多層次調(diào)控，決定了不同的內(nèi)皮功能結(jié)局。

切應(yīng)力、內(nèi)皮細胞氧化還原狀態(tài)與miRs

致動脈粥樣硬化血流（如體內(nèi)致動脈粥樣硬化模式和體外振蕩切應(yīng)力 OS）可通過促進ECs中ROS的產(chǎn)生與積累，導(dǎo)致內(nèi)皮功能紊亂并推動血管疾病進展。ECs 的氧化還原狀態(tài)由 NADPH 氧化酶（NOX）、eNOS、SOD 等多種酶介導(dǎo)，而miRs在此過程中起關(guān)鍵調(diào)控作用（圖 2）。OS 會上調(diào)靶向抗氧化基因的 miRs，下調(diào)靶向促氧化基因的 miRs，進而破壞氧化還原平衡；相反，抗動脈粥樣硬化血流（如體內(nèi)保護模式和體外脈動切應(yīng)力 PS）對 miR 網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控作用與之相反，可維持氧化還原穩(wěn)態(tài)。相關(guān) miR 對 ECs 氧化還原及炎癥狀態(tài)的調(diào)控機制總結(jié)于表1。

圖 2    響應(yīng)血流調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞氧化還原狀態(tài)的潛在miR網(wǎng)絡(luò)示意圖。

表1    剪切力誘導(dǎo)的miRs及其在內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激和炎癥中的作用。

NOX 激活是內(nèi)皮細胞中 ROS 的主要來源，內(nèi)皮細胞表達 NOX2 和 NOX4 兩種催化亞基，其激活依賴 p47phox 磷酸化及質(zhì)膜易位結(jié)合 p67phox。研究發(fā)現(xiàn) NOX 組分受微小 RNA（miRs）調(diào)控，如 NOX4 是 miR-25 的已驗證靶點、可能受 miR-23b 靶向，PS誘導(dǎo)的 miR-23b 或通過下調(diào) NOX4 增強血管抗氧化能力；NOX2 亞基 p47phox 可能被 miR-17-5p 等 miRs 靶向，表明剪切應(yīng)力可通過調(diào)控 miRs 靶向多個 NOX 亞基，精細調(diào)節(jié) ROS 生成。

SOD 等抗氧化酶通過轉(zhuǎn)化 ROS 維持氧化還原平衡，致動脈粥樣硬化流可能通過上調(diào) miRs 抑制抗氧化基因表達。miRs 網(wǎng)絡(luò)在 PS 與 OS 中呈現(xiàn)復(fù)雜調(diào)控：miR-21 在 PS 下關(guān)聯(lián) eNOS 活性發(fā)揮保護作用，在 OS 下因靶向 SOD3 等促氧化；miR-30b 可抑制過氧化氫酶，PS 下調(diào)的 miR-17 * 靶向多種抗氧化酶基因，OS 或通過 miR-872 下調(diào) SOD1。此外，硫氧還蛋白（Trx）及其相互作用蛋白（Trxnip）可能受剪切應(yīng)力響應(yīng)性 miRs 調(diào)控，如 miR-17 等靶向 Txnip 具保護作用，Trx 的 miRs 調(diào)控機制尚待明確，需進一步研究其對內(nèi)皮的影響。

內(nèi)皮型 eNOS 來源的 NO 與 ROS 的平衡是維持內(nèi)皮功能的關(guān)鍵，NO 生物利用度降低會損害內(nèi)皮功能。剪切應(yīng)力通過 miRs 多維度調(diào)控 eNOS：PS 誘導(dǎo)的 KLF2 降低靶向 eNOS 的 miR-214，miR-221/222 和 miR-92a 通過靶向 ITGA5 及 KLF2 間接抑制 eNOS；翻譯后水平上，PS 通過 AMPK 磷酸化與 SIRT1 去乙酰化協(xié)同激活 eNOS，而 OS 下 miR-217 和 miR-33 可削弱該過程。此外，miR-148a 通過抑制促動脈粥樣硬化的 ROCK1 增加 eNOS 活性，揭示剪切應(yīng)力通過 miRNA 網(wǎng)絡(luò)對 eNOS-NO 通路的多維度調(diào)控機制。

剪切應(yīng)力對內(nèi)皮細胞炎癥狀態(tài)及 miRs 的調(diào)控

內(nèi)皮細胞的低炎癥應(yīng)激狀態(tài)是其功能正常的標(biāo)志之一，而剪切應(yīng)力通過調(diào)控 miRs 影響內(nèi)皮炎癥狀態(tài)：PS 通過下調(diào)促炎分子、上調(diào)抗炎 miRs（如 miR-10a、miR-30b、miR-181b）發(fā)揮抗炎作用（圖 3）。這些 miRs 可通過靶向 MAP3K7、βTRC、importin-33 等分子抑制 NF-κB 通路激活，進而減少 IL-6、VCAM-1 等炎癥因子和黏附分子的表達，阻止單核細胞募集；相反，致動脈粥樣硬化血流會通過上調(diào)促炎分子、下調(diào)抗炎分子誘導(dǎo)內(nèi)皮促炎狀態(tài)。該機制揭示了剪切應(yīng)力通過 miR-NF-κB 通路調(diào)控內(nèi)皮炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵作用，為動脈粥樣硬化等炎癥相關(guān)心血管疾病的防治提供了新視角。

圖 3    調(diào)控促炎 NF-κB 通路的假定 miR 網(wǎng)絡(luò)。

AngⅡ 是 NF-κB 通路的強效激活劑，而 PS 可通過上調(diào) miR-155 靶向 AngⅡ 受體 1、上調(diào) miR-143/145 靶向血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）以降低 AngⅡ 水平，從而抑制該通路激活來減輕內(nèi)皮炎癥。KLF2對功能性內(nèi)皮至關(guān)重要，其誘導(dǎo)的 miR-23b 可通過靶向 MAPK 結(jié)合蛋白 2 和 3 及 IκB 激酶 -α（IKKB-α）來抑制 NF-κB 和 MAPK8/JNK 通路激活，誘導(dǎo)的 miR-126 能抑制 VCAM-1 及 NF-κB，且 KLF2 誘導(dǎo)的 miR-143/145 可靶向 FRA-1 以抑制 miR-21 轉(zhuǎn)錄，進而避免 miR-21 靶向 PPARα 和 PPARγ 而維持 PPARα 對 NF-κB 和 AP-1 通路的抑制作用來負調(diào)控促炎基因表達。此外，OS 上調(diào)的 miR-663 雖不直接結(jié)合 KLF4 mRNA，但敲低 miR-663 可增加 KLF4 轉(zhuǎn)錄并減少 VCAM-1 和 E - 選擇素轉(zhuǎn)錄，而 KLF4 對增強內(nèi)皮功能起積極作用，故影響 KLF4 上游信號或轉(zhuǎn)錄激活的 miRNA 可能對內(nèi)皮功能產(chǎn)生不利影響。

miRs 在剪切應(yīng)力調(diào)控內(nèi)皮細胞周期、細胞骨架及間隙連接中的作用

與不同血流模式相關(guān)的內(nèi)皮細胞特異性表型包括增殖或靜止等，抗動脈粥樣硬化血流下的內(nèi)皮細胞增殖能力低，其靜止?fàn)顟B(tài)通過阻止細胞進入 S 期維持，而剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的 KLF2 對該靜止?fàn)顟B(tài)至關(guān)重要。這可能與 KLF2 調(diào)控 miR-23b 有關(guān)，PS 敏感的 miR-23b 與 Rb 蛋白 E2F1 低磷酸化相關(guān)，可增強低磷酸化 Rb 與 E2F1 的抑制性結(jié)合以阻滯細胞周期進程，不過 miR-23b 抑制 Rb 磷酸化的機制有待研究。

剪切應(yīng)力通過影響連接蛋白和 VE-cadherin 等細胞間連接蛋白調(diào)節(jié)內(nèi)皮通透性和完整性。紊亂血流可上調(diào)內(nèi)皮細胞中 Cx43，以 PS 為主的動脈區(qū)域內(nèi)皮邊界 VE-Cad 表達上調(diào)，雖然缺乏剪切應(yīng)力通過 miRs 調(diào)控連接蛋白的直接數(shù)據(jù)，但連接蛋白和 VE-cadherin 可被 miRs 靶向，故其可能參與剪切應(yīng)力對內(nèi)皮通透性的調(diào)控。

不同血流模式會使內(nèi)皮細胞形態(tài)不同，OS 或紊亂血流誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞呈圓形且肌動蛋白絲隨機短分布，暴露于 PS 的內(nèi)皮細胞則伸長并沿血流方向排列，肌動蛋白應(yīng)力纖維有序平行，剪切應(yīng)力響應(yīng)性 miR-155 可能通過降低 RhoA 表達介導(dǎo)血流對內(nèi)皮細胞骨架組織的影響，而 PAK 表達可被低剪切應(yīng)力上調(diào)，因 miR-126 在斑馬魚中通過抑制 PAK1 調(diào)節(jié)血管完整性，故推測致動脈粥樣硬化血流可能通過抑制 KLF2 誘導(dǎo)的 miR-126 來上調(diào) PAK。

內(nèi)皮細胞中剪切應(yīng)力調(diào)控 miRs 的未來研究方向

當(dāng)前對剪切應(yīng)力調(diào)控 miR 及 miR 調(diào)控內(nèi)皮細胞功能的研究，多基于單個或少數(shù)時間點的線性分析，而內(nèi)皮細胞中 miR 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)因機械傳感器和信號級聯(lián)的時空參與、多 miR 靶向共同 mRNA、多轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控 miR 基因以及 miR 協(xié)同調(diào)控細胞表型等因素變得復(fù)雜，故未來研究需引入時間分辨率和系統(tǒng)分析方法，以闡明事件間的因果關(guān)系。

由于內(nèi)皮細胞的機械轉(zhuǎn)導(dǎo)反應(yīng)具有整合性和動態(tài)性，涉及多步驟的信號及基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)時，需通過時間和因果分析來捕捉代表性組件關(guān)系（圖 4）。為研究內(nèi)皮細胞中動態(tài)的機械轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，可借助 PTMScout 等預(yù)測程序推導(dǎo) PTM 參與的 miR 調(diào)控通路，并通過蛋白質(zhì)組學(xué)和基因操作實驗驗證；利用 TRANSFAC®、JASPAR 等數(shù)據(jù)庫及 ChIP-seq 技術(shù)，可確定轉(zhuǎn)錄因子與 miR 啟動子的結(jié)合位置；通過 WormBase  WS159 獲取 3'UTR 序列并結(jié)合 PicTar 等程序可預(yù)測 miR 靶標(biāo)，而 FIRM 算法和 KeyMolnet 模型則能進一步分析 miR 對 mRNA 的直接或間接調(diào)控及分子互作網(wǎng)絡(luò)，為揭示 miR 介導(dǎo)的血流表型機制提供工具。

鑒于內(nèi)皮細胞表型是機械敏感信號和基因表達事件隨時間累積的結(jié)果，需借助時間依賴性數(shù)據(jù)集構(gòu)建具有時間相關(guān)性的 miRNA 網(wǎng)絡(luò)，而基于分子實驗的計算機建?？商嵘毎推鞴偎焦δ茯炞C的可靠性。

圖 4   推導(dǎo)miR調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及信號通路的網(wǎng)絡(luò)示意圖。

總之，體內(nèi)剪切應(yīng)力通過機械轉(zhuǎn)導(dǎo)高度調(diào)控內(nèi)皮功能，影響其氧化還原與炎癥狀態(tài)。miRs在內(nèi)皮細胞響應(yīng)剪切應(yīng)力中起關(guān)鍵作用：PS 誘導(dǎo)的 miRs 可抑制氧化應(yīng)激與炎癥，維持血管穩(wěn)態(tài)；OS 則激活相反的 miR 網(wǎng)絡(luò)。

參考文獻：Marin T, Gongol B, Chen Z, Woo B, Subramaniam S, Chien S, Shyy JY. Mechanosensitive microRNAs-role in endothelial responses to shear stress and redox state. Free Radic Biol Med. 2013 Sep;64:61-8. doi: 10.1016/j.freeradbiomed.2013.05.034. Epub 2013 May 30. PMID: 23727269; PMCID: PMC3762952.

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