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雙熒光素酶報告基因檢測 實驗常見問題與解答

來源:北京蘭博利德商貿(mào)有限公司   2025年07月21日 09:29  

在分子生物學研究中,雙熒光素酶報告基因檢測實驗因其高靈敏度、操作便捷和結(jié)果可靠,被廣泛應用于啟動子活性分析、miRNA靶基因驗證、轉(zhuǎn)錄因子功能研究等領(lǐng)域。然而,實驗過程中常常會遇到各種問題,例如熒光值異常、重復性差等,這些問題可能會影響實驗結(jié)果的準確性。為了幫助大家更好地掌握這一技術(shù),我們整理了雙熒光素酶報告基因檢測實驗中的常見問題與解答,涵蓋了實驗設計、操作細節(jié)、數(shù)據(jù)分析等多個方面,希望這些內(nèi)容助您輕松搞定實驗!


Q1:雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灴蓱糜谀男┭芯糠较颍?/span>

A1:①驗證microRNA同mRNA靶向互作;②驗證microRNA同lncRNA/circRNA靶向互作;③驗證轉(zhuǎn)錄因子與啟動子互作;④啟動子結(jié)構(gòu)分析⑤啟動子SNP分析


Q2:如何選擇報告基因載體?

A2:螢火蟲熒光素酶基因和海腎基因(內(nèi)參)在同一個載體上,選擇pmirGLO等載體;螢火蟲熒光素酶基因和海腎基因(內(nèi)參)分別在一個載體上,可選擇pGL3/pRL系列載體;載體詳細信息可參考【干貨分享】手把手教你做雙熒光素酶實驗。


Q3:如何選擇主報告基因和內(nèi)參基因的質(zhì)粒比例?

A3:通常,主報告基因質(zhì)粒與內(nèi)參質(zhì)粒的比例,建議作一個預實驗來調(diào)整(如螢火蟲載體與海腎載體比例分別用1:10、1:20、1:50、1:100)確保內(nèi)參基因被準確檢測且不干擾主報告基因的表達。


Q4:如何保證檢測數(shù)據(jù)的有效性和真實性?

A4:①設立對照和重復:實驗中應設立陽性和陰性對照,以驗證實驗系統(tǒng)的有效性且需要做3個或3個以上復孔,并且引入另一個報告基因作為內(nèi)參,主要是同批次樣品檢測值也可能出現(xiàn)浮動,排除多種干擾因素的影響(細胞狀態(tài)、轉(zhuǎn)染效率、載體質(zhì)量、裂解速度、加樣精準度等)。②熒光值控制:熒光值過高可能會超出儀器的檢測范圍,導致無法檢測到值,一般建議將熒光值控制在5-6位之間。


Q5:熒光值過高或過低怎么辦?

A5:熒光值過高:可減少質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量,或?qū)α呀猱a(chǎn)物進行稀釋后檢測;熒光值過低:可能是轉(zhuǎn)染效率低或裂解不充分,建議優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件、增加細胞量或延長裂解時間。


Q6:復孔間重復性差如何解決?

A6:確保樣本均一性,裂解后離心取上清檢測;定期校準移液器,保證加樣準確性;轉(zhuǎn)染時混合的力度/細胞量/時間等保持一致(同個數(shù)量級內(nèi)的差異是可以接受的)。


Q7:雙熒光素酶檢測需要使用什么檢測板?

A7:建議使用全白板,優(yōu)勢是靈敏度最高而且孔間相互干擾最小。


Q8:雙熒光素酶檢測需要使用什么儀器?

A8: 化學發(fā)光儀或帶化學發(fā)光檢測模塊的酶標儀。


Q9:海腎和螢火蟲是在同一個孔里面檢測嗎?能否分開檢測?

A9:同一個孔里檢測,不會相互影響,蘭博利德的海腎熒光素酶底物中有淬滅螢火蟲熒光值的物質(zhì)??梢苑珠_檢測,但是在一個孔里檢測會更加準確。


Q10:實驗過程有哪些注意事項?

A10:①樣品混勻:保證裂解產(chǎn)物與底物快速混合、混合時間一致,避免熒光素酶衰變的影響。細胞裂解產(chǎn)物處理:細胞裂解產(chǎn)物常溫不超過6小時;-20℃一個月;-80℃半年。    反應體系:雙熒光素酶反應體系:20?μl(細胞裂解產(chǎn)物)、100?μl(螢火蟲熒光素酶底物)、100?μl(海腎熒光素酶底物),底物量可根據(jù)實際情況調(diào)整,但一定要保證底物過量,不然會造成檢測結(jié)果出現(xiàn)大的偏差。

 

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