外泌體凍干配方的研究

外泌體是由細(xì)胞分泌的直徑在30~150nm的天然生物納米囊泡，能夠以長(zhǎng)、短距離的方式來(lái)運(yùn)輸功能性生物分子，是細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞間的信使。外泌體因具有生物相容度高、免疫原性低/無(wú)、特定組織趨向性、可修飾性以及高穩(wěn)定性等優(yōu)勢(shì)，被作為天然的納米載體,廣泛應(yīng)用于藥物運(yùn)輸和疾病診斷治療等研究。然而，外泌體的運(yùn)輸和長(zhǎng)期儲(chǔ)存是限制其臨床應(yīng)用的重要因素。目前外泌體主要以-80℃儲(chǔ)存為主，但是該方法的運(yùn)輸成本較高,臨床適用性差,因此凍干技術(shù)在此方向上的應(yīng)用被廣泛關(guān)注。

凍干技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)保持物質(zhì)活性，防止其被氧化和加水易復(fù)原等優(yōu)勢(shì),并且可用于改善納米載體的穩(wěn)定性。然而,凍干過(guò)程的不良環(huán)境會(huì)對(duì)外泌體造成破壞，因此,需要添加凍干保護(hù)劑進(jìn)行保護(hù)。鑒于此,本研究嘗試了包括蔗糖、葡萄糖、賴氨酸、海藻糖、乳糖和菊糖在內(nèi)的凍干保護(hù)劑對(duì)外泌體完整性、分散性和生物學(xué)功能的影響。

通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)和超速離心法提取細(xì)胞上清外泌體、加入凍干保護(hù)劑進(jìn)行溶液配置、外泌體凍干、溶液復(fù)溶等工藝步驟后，對(duì)凍干后的外泌體進(jìn)行再評(píng)價(jià)。

真空冷凍干燥工藝選用，預(yù)凍溫度-45℃、180min，升華干燥溫度-20℃、1200min，解析干燥溫度25℃，300min。

通過(guò)對(duì)外泌體粒徑分析、免疫表征、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)等功能性測(cè)試，結(jié)果表明不同保護(hù)劑的保護(hù)效果存在較大差異。

NC:未添加保護(hù)劑、-80：對(duì)照組、保護(hù)劑：2%乳糖

上至下保護(hù)劑分別為：4%乳糖、2%海藻糖、5%菊糖

結(jié)果討論：4%乳糖和2%海藻糖能很好地解決凍干時(shí)外泌體的聚集和保護(hù)外泌體形貌完整的問(wèn)題，并且4%乳糖和2%海藻糖保護(hù)效果相當(dāng)。考慮到人體對(duì)乳糖的不耐受，最終選擇了2%海藻糖作為凍干保護(hù)劑。使用海藻糖和高分子化合物PVP40結(jié)合凍干外泌體時(shí)，外泌體完整度和分散度都很好，但使用前需要將PVP40去除，限制了其進(jìn)一步的應(yīng)用，故直接使用2%海藻糖會(huì)更加方便快捷。為了驗(yàn)證2%海藻糖凍干是否會(huì)影響外泌體本身的功能，檢測(cè)凍干后血漿來(lái)源外泌體誘導(dǎo)血管生成功能是否保留，結(jié)果發(fā)現(xiàn)凍干后的血漿來(lái)源的外泌體仍然可以誘導(dǎo)血管上皮細(xì)胞成管。同時(shí)，添加2%海藻糖凍干后的外泌體常溫儲(chǔ)存后依舊能被細(xì)胞攝取，不會(huì)影響外泌體作為納米載體的進(jìn)入細(xì)胞的固有屬性。

凍干實(shí)驗(yàn)室可以下技術(shù)服務(wù)：

1.提供外泌體凍干配方開(kāi)發(fā)。

2.提供外泌體凍干工藝曲線開(kāi)發(fā)。

3.提供外泌體凍干生產(chǎn)放大工藝開(kāi)發(fā)。

4.提供外泌體上下游凍干設(shè)備開(kāi)發(fā)。