層流剪切應(yīng)力通過 miR-29b-3p/CX3CL1 軸減輕單核細胞黏附與動脈粥樣硬化
Laminar shear stress alleviates monocyte adhesion and atherosclerosis development via miR-29b-3p/CX3CL1 axis regulation
Keywords: Laminar shear stress, Atherosclerosis, CX3CL1, Monocyte adhesion, MiR-29b-3p
流體剪切應(yīng)力是血流作用于血管內(nèi)皮的摩擦力,血管內(nèi)皮細胞能將其變化轉(zhuǎn)化為生物信號,調(diào)節(jié)生理過程。血流狀態(tài)決定剪切應(yīng)力形式,直行血管產(chǎn)生層流剪切應(yīng)力(Lss),血管分支、分叉或彎曲處則出現(xiàn)振蕩或湍流。大量研究表明,直行血管 AS 發(fā)病率低,分叉和彎曲處發(fā)病率高,意味著 Lss 具有重要抗 AS 作用。
CX3CL1 作為由 373 個氨基酸組成的 CX3C 趨化因子家族成員,以分泌型和膜結(jié)合型兩種形式存在,兼具趨化因子和黏附分子雙重功能,與神經(jīng)系統(tǒng)疾病、骨代謝疾病和心血管疾病等多種系統(tǒng)性疾病相關(guān),其可介導單核細胞遷移黏附,促使單核細胞募集至血管壁破壞內(nèi)皮細胞功能并誘導 AS 斑塊形成。而低剪切應(yīng)力會激活 CX3CL1 誘導單核細胞黏附于激活的內(nèi)皮細胞,Lss 則能降低 CX3CL1 表達以抑制 AS 進展。miRNAs 可通過調(diào)控細胞生長、分化等多種生物過程在疾病發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用,且 Lss 能通過調(diào)控 miRNAs 維持內(nèi)皮細胞功能穩(wěn)定來發(fā)揮抗 AS 作用。
基于此,吉林大學基礎(chǔ)醫(yī)學院人獸共患病教育部重點實驗室的研究團隊結(jié)合生物信息學和分子生物學等方法,對 Lss 敏感的 miR - 29b - 3p/CX3CL1 軸在體內(nèi)和體外對內(nèi)皮細胞炎癥及 AS 發(fā)生發(fā)展的影響進行探究。研究成果發(fā)表在 Journal of cell science 期刊題為“Laminar shear stress alleviates monocyte adhesion and atherosclerosis development via miR-29b-3p/CX3CL1 axis regulation”。
首先,為了鑒定人主動脈內(nèi)皮細胞中 Lss 敏感的 mRNA,研究對靜態(tài)和 Lss 處理的 HAECs、HUVECs 進行全轉(zhuǎn)錄組測序,通過 edgR 軟件篩選出差異表達 mRNA。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與靜態(tài)組相比,Lss 組中 452 個 mRNA 表達顯著改變(圖 1A),其中 297 個上調(diào)、155 個下調(diào)(圖 1C)。此外,通過分析高通量測序數(shù)據(jù),對比HUVECs - 靜態(tài)組與 HUVECs-Lss 組,發(fā)現(xiàn) Lss 組中 1349 個 mRNA 表達顯著改變(圖 1B),其中 496 個上調(diào)、853 個下調(diào)(圖 1D)。為探究 Lss 對血管內(nèi)皮細胞功能的影響,研究發(fā)現(xiàn)在 Lss 處理的 HAECs 和 HUVECs 中均下調(diào)的 25 個 mRNA 作為關(guān)鍵 mRNA(圖 1E;表 1), 其富集的 GO 功能和 KEGG 通路與 AS 發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)(圖 1F-J), 構(gòu)建的 PPI 網(wǎng)絡(luò)包含 21 個節(jié)點和 36 條邊(圖 1K,L)。研究表明,CXCR4、APLN、CX3CL1、CSF1 和 HES1 參與 AS 發(fā)生發(fā)展。通過 qRT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn),Lss 處理的 HAECs 中 CX3CL1、CSF1 和 HES1 的 mRNA 表達降低(圖 1M),其中 CX3CL1顯著下調(diào),且在 HUVECs 中也得到驗證(圖 1N)。同時 HAECs-Lss 組的細胞上清液和細胞內(nèi)蛋白表達量均較靜態(tài)組降低(圖 1O-Q)。上述結(jié)果表明,Lss 可降低內(nèi)皮細胞中 CX3CL1 的 mRNA 和蛋白表達,證實 CX3CL1 是 Lss 敏感基因。
圖1 在低切應(yīng)力條件下,內(nèi)皮細胞的 CX3CL1 表達下調(diào)。
表 1 在低切應(yīng)力條件下,GSE103672 數(shù)據(jù)集中 HAECs 和 HUVECs 中均下調(diào)的 mRNA。
為了探究 CX3CL1 對人主動脈內(nèi)皮細胞(HAECs)生物學功能的影響,研究通過轉(zhuǎn)染RNA(shRNAs)構(gòu)建了 CX3CL1 敲低的細胞模型。結(jié)果顯示 sh-CX3CL1-1 的敲低效率高(圖 2A ),故選取其用于后續(xù)研究,而 sh-CX3CL1-3 轉(zhuǎn)染后 CX3CL1 表達量急劇增加的原因尚不明確。 研究表明,內(nèi)皮細胞 CX3CL1 可誘導單核細胞黏附并損害血管內(nèi)皮功能。qRT-PCR 和 western blotting 顯示,TNF-α 能誘導 HAECs 中 CX3CL1、VCAM-1 和 ICAM-1 的 mRNA 及蛋白表達升高,而轉(zhuǎn)染 sh-CX3CL1-1 可抑制這些分子的表達(圖 2B-D)。同時 CX3CL1 表達降低會抑制 TNF-α 刺激的單核細胞黏附增強(圖 2E-F)。
接著,為了探究 Lss 是否通過調(diào)控 CX3CL1 影響內(nèi)皮細胞功能,研究構(gòu)建了 CX3CL1 過表達 HAECs 模型(圖 2G)。結(jié)果顯示 Lss 可顯著抑制 TNF-α 刺激引起的 CX3CL1、VCAM-1 和 ICAM-1 表達升高,而 CX3CL1 過表達則逆轉(zhuǎn)了 Lss 的這一抑制作用(圖 2H-J)。且單核細胞黏附分析表明,CX3CL1 過表達部分逆轉(zhuǎn)了 Lss 對 TNF-α 刺激的單核細胞黏附增強的抑制效應(yīng)(圖 2K-L)。這些結(jié)果表明, Lss 通過抑制 CX3CL1 表達來減弱單核細胞對激活的 HAECs 的黏附。
圖 2 低切應(yīng)力通過抑制 CX3CL1 的表達,損害單核細胞與激活的 HAECs的黏附。
miRNA 表達對流體剪切應(yīng)力敏感,且受其調(diào)控的 miRNA 是心血管疾病治療潛在靶點,為了分析 Lss 保護內(nèi)皮細胞功能的分子機制,研究對響應(yīng) Lss 調(diào)控 CX3CL1 表達的上游 miRNA進行研究。研究通過借助 TargetScan 和 DIANA TOOLS 數(shù)據(jù)庫預(yù)測到 miR-424-5p、miR-497-5p、miR-29c-3p、miR-29a-3p 和 miR-29b-3p 這 5 個與 CX3CL1 存在保守結(jié)合位點的上游 miRNA(圖 3A,表 2)。qRT-PCR 顯示 Lss 處理后 miR-29b-3p 表達上調(diào)顯著(圖 3B)。為進一步證實 miR-29b-3p 與 CX3CL1 的相互作用 ,研究構(gòu)建 CX3CL1-3′UTR 野生型和突變型的熒光素酶報告基因載體,以及 miR-29b-3p 模擬物和陰性對照。結(jié)果顯示 miR-29b-3p 過表達顯著抑制野生型載體的熒光素酶活性,突變型則無此效果(圖 3D)。在 HAECs 中構(gòu)建的 miR-29b-3p 過表達或敲低模型后,miR-29b-3p 的表達相應(yīng)地上調(diào)或下調(diào),表明成功構(gòu)建了 miR-29b-3p 過表達或敲低的細胞模型(圖 3E,I)。進一步驗證顯示,miR-29b-3p 的過表達抑制了 CX3CL1 的 mRNA 和蛋白表達,而 miR-29b-3p 的敲低則促進了 CX3CL1 的 mRNA 和蛋白表達(圖 3F-H,J-L)。上述結(jié)果證實 CX3CL1 是 miR-29b-3p 的直接靶基因。
圖 3 CX3CL1 是 miR-29b-3p 的直接靶基因。
表 2 利用 TargetScan 和 DIANA TOOLS 預(yù)測的可能結(jié)合 CX3CL1 的 miRNAs。
如圖 4A 所示,TNF-α 可誘導 HAECs 中 miR-29b-3p 表達下調(diào),而轉(zhuǎn)染 pri-miR-29b-3p 可恢復(fù) miR-29b-3p 的表達,表明在 TNF-α 激活的 HAECs 中成功實現(xiàn)了 miR-29b-3p 的過表達。接下來,對miR-29b-3p 是否在 TNF-α 激活的 HAECs 中調(diào)控 CX3CL1 的表達進行了研究。qRT-PCR 和 western blotting 結(jié)果顯示,miR-29b-3p 過表達能顯著抑制 TNF-α 誘導的 CX3CL1、VCAM-1和ICAM-1的 mRNA 及蛋白表達升高,并抑制單核細胞黏附增強(圖 4B-I)。
為了進一步驗證 miR-29b-3p 是否通過調(diào)控 CX3CL1 抑制單核細胞黏附,將 pri-miR-29b-3p 與 pri-CX3CL1 共轉(zhuǎn)染至 TNF-α 激活的 HAECs 中。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在 TNF-α 激活的 HAECs 中 ,CX3CL1 過表達可消除 miR-29b-3p 對 CX3CL1、VCAM-1、ICAM-1 表達及單核細胞黏附的抑制作用(4J-N)。此外,在施加 Lss 條件下,敲低 miR-29b-3p 可逆轉(zhuǎn) Lss 對 TNF-α 誘導的 CX3CL1、VCAM-1、ICAM-1 表達及單核細胞黏附的抑制效應(yīng)(圖 4R,S)。綜上,研究證實 Lss 通過調(diào)控 miR-29b-3p/CX3CL1 軸,抑制 CX3CL1 及其下游黏附分子表達,從而減弱單核細胞對激活的 HAECs 的黏附。
圖 4 低切應(yīng)力通過調(diào)控 miR-29b-3p/CX3CL1 軸損害單核細胞與激活的 HAECs 的黏附。
NF-κB 信號通路在炎癥調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用,已有研究表明內(nèi)皮 miRNA 可通過調(diào)節(jié)該通路影響單核細胞黏附。為了明確 Lss 敏感的miR-29b-3p/CX3CL1 軸調(diào)控內(nèi)皮細胞黏附的分子機制,研究分析了其對 TNF-α 激活的HAECs 中NF-κB 信號通路的影響。實驗顯示,Lss 能抑制 TNF-α 誘導的VCAM-1、ICAM-1 上調(diào),顯著抑制 TNF-α 誘導的 p65 和 IκBα 的磷酸化(圖 5A,B),并且Lss 顯著減少了 p65的積累和核轉(zhuǎn)位(圖 5C-F),表明 Lss 可通過抑制 NF-κB 信號激活調(diào)節(jié)內(nèi)皮炎癥。敲低 miR-29b-3p 會逆轉(zhuǎn) Lss 對 NF-κB 信號通路的抑制作用(圖 5E)。此外,miR-29b-3p 過表達或 CX3CL1 敲低均能顯著抑制 TNF-α 刺激下VCAM-1、ICAM-1 的上調(diào)及 p65、IκBα 磷酸化圖 (5G,H ),減少 p65 核積累與核轉(zhuǎn)位(圖 5I-K)。綜上,Lss 敏感的 miR-29b-3p/CX3CL1 軸通過阻斷 NF-κB 信號通路,減輕內(nèi)皮細胞炎癥反應(yīng)。
圖5 低切應(yīng)力敏感的 miR-29b-3p/CX3CL1 軸通過阻斷 HAECs 中的 NF-κB 信號通路來緩解炎癥。
最后,為了在體內(nèi)驗證 Lss 與 miR-29b-3p、CX3CL1 的關(guān)聯(lián),研究檢測了 ApoE?/?小鼠主動脈弓(湍流 Oss 作用)和胸降主動脈(Lss 作用)內(nèi)膜中相關(guān)分子的表達,發(fā)現(xiàn) Lss 作用的胸主動脈內(nèi)膜中 miR-29b-3p 表達上調(diào),CX3CL1 表達下調(diào),而主動脈弓的結(jié)果與之相反;體外實驗也表明,振蕩剪切應(yīng)力(0.5±4 dyn/cm2) 處理人主動脈內(nèi)皮細胞(HAECs)會導致 CX3CL1 表達上調(diào)、miR-29b-3p 表達下調(diào)。
為了進一步驗證 miR-29b-3p 在體內(nèi)對 AS進展的調(diào)控作用,研究將 6 周齡雄性 ApoE?/?小鼠分為正常飲食(ND)組和高脂飲食(HFD)組喂養(yǎng) 4 個月,最后 1 個月注射 agomir-miR-29b-3p 或陰性對照(圖 6A)。結(jié)果顯示,HFD 顯著降低小鼠主動脈內(nèi)膜 miR-29b-3p 表達,而注射 agomir-miR-29b-3p 可恢復(fù)其表達(圖 6B) 并抑制 CX3CL1 的 mRNA 和蛋白水平。生化檢測表明,HFD 導致小鼠血清 HDL-C 降低,TG、TC 和 LDL-C 升高,miR-29b-3p 過表達則逆轉(zhuǎn)了這些血脂異常(圖 6C-F)。主動脈形態(tài)學觀察顯示,HFD 組小鼠主動脈內(nèi)膜增厚、斑塊形成,而 miR-29b-3p 過表達顯著減小了斑塊面積(圖 6G),油紅 O 染色也證實miR-29b-3p 過表達能部分減輕HFD 誘導的主動脈內(nèi)膜脂質(zhì)沉積(圖 6H-I)。上述結(jié)果表明,miR-29b-3p 在體內(nèi)可改善 AS 進展。
本研究還探討了miR-29b-3p 是否通過調(diào)控 CX3CL1 表達來調(diào)節(jié) AS 小鼠的內(nèi)膜炎癥,從而影響 AS 發(fā)展。Western blotting 結(jié)果顯示,miR-29b-3p 過表達逆轉(zhuǎn)了 HFD 喂養(yǎng)的 ApoE?/?小鼠主動脈內(nèi)膜中 CX3CL1、VCAM-1 和 ICAM-1 的蛋白表達升高(圖 6J,K)。免疫組織化學染色也表明,HFD 組小鼠主動脈中 CX3CL1 和 VCAM-1 的表達顯著增加,而 miR-29b-3p 過表達則下調(diào)了其表達(圖 6L)。綜上,miR-29b-3p 在體內(nèi)通過抑制 CX3CL1 及其下游黏附分子的表達,減輕內(nèi)皮細胞炎癥,進而改善 AS。
圖 6 miR-29b-3p 通過緩解 HFD 誘導的內(nèi)皮炎癥,改善 ApoE?/?小鼠的 AS。
總之,研究揭示了 Lss 敏感的 miR-29b-3p/CX3CL1 軸可顯著抑制單核細胞對激活的人主動脈內(nèi)皮細胞的黏附,并減輕高脂飲食喂養(yǎng)的 ApoE?/?小鼠的局部炎癥和斑塊形成。
參考文獻:Pu L, Meng Q, Li S, Wang Y, Sun B, Liu B, Li F. Laminar shear stress alleviates monocyte adhesion and atherosclerosis development via miR-29b-3p/CX3CL1 axis regulation. J Cell Sci. 2022 Jul 15;135(14):jcs259696. doi: 10.1242/jcs.259696. Epub 2022 Jul 22. PMID: 35735031; PMCID: PMC9450891.
圖片來源:所有圖片均來源于參考文獻
小編旨在分享、學習、交流生物科學等領(lǐng)域的研究進展。如有侵權(quán)或引文不當請聯(lián)系小編修正。如有任何的想法以及建議,歡迎聯(lián)系小編。感謝各位的瀏覽以及關(guān)注!關(guān)注“Naturethink”公眾號,了解更多相關(guān)內(nèi)容。
相關(guān)產(chǎn)品
免責聲明
- 凡本網(wǎng)注明“來源:化工儀器網(wǎng)”的所有作品,均為浙江興旺寶明通網(wǎng)絡(luò)有限公司-化工儀器網(wǎng)合法擁有版權(quán)或有權(quán)使用的作品,未經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)不得轉(zhuǎn)載、摘編或利用其它方式使用上述作品。已經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)使用作品的,應(yīng)在授權(quán)范圍內(nèi)使用,并注明“來源:化工儀器網(wǎng)”。違反上述聲明者,本網(wǎng)將追究其相關(guān)法律責任。
- 本網(wǎng)轉(zhuǎn)載并注明自其他來源(非化工儀器網(wǎng))的作品,目的在于傳遞更多信息,并不代表本網(wǎng)贊同其觀點和對其真實性負責,不承擔此類作品侵權(quán)行為的直接責任及連帶責任。其他媒體、網(wǎng)站或個人從本網(wǎng)轉(zhuǎn)載時,必須保留本網(wǎng)注明的作品第一來源,并自負版權(quán)等法律責任。
- 如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問題,請在作品發(fā)表之日起一周內(nèi)與本網(wǎng)聯(lián)系,否則視為放棄相關(guān)權(quán)利。