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在基因研究中，無(wú)縫克隆試劑盒是將特定基因片段準(zhǔn)確連接到載體上的得力工具。對(duì)于科研小白，它的操作雖不復(fù)雜，但了解其原理和步驟很關(guān)鍵。
無(wú)縫克隆基于同源重組原理。通過(guò)特殊引物給目的基因兩端加上與線性化載體末端互補(bǔ)的 “特殊標(biāo)簽”，再利用試劑盒里的重組酶，將二者精準(zhǔn)連接，避免了傳統(tǒng)克隆中限制性內(nèi)切酶的復(fù)雜操作 。
使用時(shí)，先設(shè)計(jì)引物，用 PCR 擴(kuò)增出帶 “特殊標(biāo)簽” 的目的基因片段，并純化。同時(shí)，根據(jù)載體特點(diǎn)，選擇酶切或 PCR 擴(kuò)增的方式將其線性化并純化 。之后，按說(shuō)明書(shū)將目的基因片段、線性化載體與試劑盒中的重組酶混合液、反應(yīng)緩沖液配成反應(yīng)體系，50℃孵育 30 分鐘 - 1 小時(shí)，完成連接 。接著把連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)培養(yǎng)篩選出陽(yáng)性克隆，最后通過(guò)菌落 PCR、DNA 測(cè)序等驗(yàn)證克隆是否成功 。
無(wú)縫克隆試劑盒優(yōu)勢(shì)明顯，克隆效率高，連接精準(zhǔn)，能保留基因原始序列；適用多種載體和基因片段；操作簡(jiǎn)單，無(wú)需復(fù)雜設(shè)備和技術(shù)，大大降低實(shí)驗(yàn)門(mén)檻，助力科研小白快速開(kāi)啟基因研究之旅。
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