一、背景

人肺動脈內(nèi)皮細胞是提取于人肺組織的原代細胞系，血管內(nèi)皮細胞主要作用是維持血管的動態(tài)平衡。此細胞能合成和分泌凝血和纖溶系統(tǒng)中的活化和抑制因子，同時也能合成和分泌影響著血小板粘附和聚集的某些介質(zhì)。內(nèi)皮細胞還可以釋放具有調(diào)控細胞增殖和血管壁張力功能的分子。人肺動脈內(nèi)皮細胞上的腺苷受體被脂多糖激活后，會引起參與急性肺損傷的病生理過程的IL-6的釋放。許多此類以及其他的作用過程可以應(yīng)用培養(yǎng)的細胞在體外研究進行研究，人肺動脈內(nèi)皮細胞正是這類研究中普遍應(yīng)用的細胞類型。

二、細胞培養(yǎng)步驟

培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1）準(zhǔn)備RPMI-1640培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2）培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

三、細胞處理方法

1）復(fù)蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓毎麘乙杭尤?50px皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。

2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

3.按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4.將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

3）細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。

四、應(yīng)用

用于香煙煙霧提取物經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激CHOP信號通路促進人肺動脈內(nèi)皮細胞凋亡研究：

明確香煙煙霧提取物是否經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激CHOP信號通路促進人肺動脈內(nèi)皮細胞凋亡,以及苯基丁酸（PBA）是否具有凋亡抑制作用。

方法：通過慢病毒轉(zhuǎn)染重組RNA沉默HPAEC人肺動脈內(nèi)皮細胞CHOP基因表達,將未進行CHOP基因干預(yù)的HPAEC人肺動脈內(nèi)皮細胞及CHOP基因沉默的HPAEC-CHOP人肺動脈內(nèi)皮細胞各自分為對照組（Ctrl組,常規(guī)培養(yǎng)不作特殊處理）、香煙煙霧提取物組（CSE組,培養(yǎng)基中加入10%香煙煙霧提取物）、苯基丁酸組（PBA組,培養(yǎng)基中加入5mmol/L的PBA）和香煙煙霧提取物聯(lián)合苯基丁酸組（CSE+PBA組,培養(yǎng)基中加入10%香煙煙霧提取物以及5mmol/L的PBA）,各組細胞分別處理6h、12h、24h,收集后用于后續(xù)實驗。通過透射電鏡觀察細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)變化,利用流式細胞儀檢測細胞凋亡比例,Western-blot檢測CHOP蛋白表達水平,Realtime-PCR檢測CHOP mRNA表達水平。P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果：

1、HPAEC-CHOP細胞CHOP蛋白表達水平較HPAEC細胞降低大于80%,說明CHOP基因沉默達到預(yù)期效果。

2、透射電鏡觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)。Ctrl組以及PBA組HPAEC細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)正常,CSE組HPAEC細胞出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹（表現(xiàn)為體積增大和折疊變平變淺）,CSE+PBA組HPAEC細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹程度較CSE組HPAEC細胞減輕。Ctrl組、PBA組以及CSE+PBA組HPAEC-CHOP細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)基本正常;CSE組HPAEC-CHOP細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無明顯腫脹,但是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜電子密度增高。

3、流式細胞儀檢測細胞凋亡比例。HPAEC細胞不同處理組相同處理時間比較:PBA組凋亡比例與Ctrl組無差異;CSE組凋亡比例高于Ctrl組和PBA組;CSE+PBA組凋亡比例高于Ctrl組和PBA組,但是低于CSE組。HPAEC細胞不同CSE處理時間組比較,處理12h組高于處理6h組,處理24h組高于處理12h組。HPAEC-CHOP細胞不同處理組相同處理時間比較:PBA組凋亡比例與Ctrl組無差異;CSE組凋亡比例高于Ctrl組和PBA組;CSE+PBA組凋亡比例高于Ctrl組和PBA組,但是低于CSE組。HPAEC-CHOP細胞不同CSE處理時間組比較,凋亡比例無顯著性差異。相同處理時間HPAEC-CHOP細胞與HPAEC細胞比較:HPAEC-CHOP細胞CSE組凋亡比例低于HPAEC細胞的CSE組;HPAEC-CHOP細胞CSE+PBA組凋亡比例低于HPAEC細胞的CSE組;HPAEC-CHOP細胞CSE+PBA組凋亡比例低于HPAEC細胞的CSE+PBA組。

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