標準品標準曲線的繪制
上海滬峰是由留學美國多年的資深學者創(chuàng)辦的一家*企業(yè),與中國農業(yè)大學、華中農業(yè)大學、哈爾濱獸醫(yī)研究所等多家高校及生物技術研究機構建立了合作關系。公司以開發(fā)的動物疾病診斷試劑、食品安全檢測試劑、人體疾病診斷試劑、環(huán)境監(jiān)測試劑、新型酶制劑、微生物制劑、蛋白質產品、核苷酸產品、綠色水產藥品、小分子抗原抗體、基因重組抗原抗體等生物化學制品為主,以*的化企業(yè)經營理念、雄厚的研發(fā)實力、規(guī)范化的生產標準、健全的銷售網絡、完善的技術服務體系和廣闊的國內外合作網絡服務于,致力于生物制劑在的產業(yè)化。
1. 定量定義 定量是用已知濃度的標準品繪制標準曲線來推算未知樣品的量。 將標準品稀釋至不同濃度,作為模板進行 PCR 反應。以標準品拷貝數(shù)的對數(shù)值為 橫坐標,以測得的 CT 值為縱坐標,繪制標準曲線,對未知樣品進行定量時,根據(jù)未知樣品 的 CT 值,即可在標準曲線中得到樣品的拷貝數(shù)。 * Log(起始濃度)與循環(huán)數(shù)呈線性關系, 通過已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線, 即得 到該擴增反應存在的線性關系 * 由樣品 CT 值,就可以計算出樣品中所含的模板量
2. 定量標準品 標準品的一些標準 * 必須用與擴增目的基因相同的引物進行擴增,并且擴增效率相同 * 標準品必須是經過準確定量的(我們通常用的是 ASP-3700 紫外光/可見光微量分光光度 計) * 標準品必須是標準化的(例如,同一化的細胞數(shù)) * 在每組實驗時,必須用相同的閾值設定來確定 CT 值 標準品可以是含有目的基因的線性化的質粒 DNA,也可以是比擴增片段長的純化 后的 PCR 產物,當然也可以是基因組 DNA,甚至 cDNA,但前提是所有的作為標準品的核 酸都必須保證穩(wěn)定。
3. 標準品的制備
一般一條標準曲線取四到五個點, 濃度范圍要能覆蓋樣品的濃度區(qū)間, 以保證定量的準確性。 一般一個點重復三至五次, 對于常期穩(wěn)定使用的標準品可以適當減少重復的次數(shù)。
倍比梯度稀釋方法: 1v 原液(標準品 i)+9v 稀釋緩沖液,得標準品 ii 1v 標準品 ii+9v 稀釋緩沖液,得標準品 iii 1v 標準品 iii+9v 稀釋緩沖液,得標準品 iv 1v 標準品 iv+9v 稀釋緩沖液,得標準品 v 依次倍比稀釋 拷貝數(shù)的計算:詳見核酸拷貝數(shù)的計算 4. 實例 標準品的制作:將標準品依次進行 10 倍稀釋,ASP-3700 測得其拷貝數(shù) 1.55×108copy /ul 標準曲線的繪制(1cycle=1min) 設置對照:濃度為 1.55×107、1.55×106、1.55×105、1.55×104、1.55×103、1.55×102、 1.55×101 的標準樣品各一個,設空白對照 PCR 反應:以不同濃度標準品作為模板
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