在生物體內(nèi)，氧化應(yīng)激是指機(jī)體在遭受各種有害刺激時，體內(nèi)活性氧（ROS）產(chǎn)生過多或抗氧化防御系統(tǒng)功能減弱，導(dǎo)致氧化與抗氧化失衡的一種狀態(tài)。抗氧化活性物質(zhì)能夠清除 ROS，減輕氧化應(yīng)激對細(xì)胞和組織的損傷。非酶法抗氧化活性檢測是評估生物樣本（如植物提取物、食品、血液等）中非酶類抗氧化物質(zhì)總活性或特定成分抗氧化能力的重要手段，在食品科學(xué)、醫(yī)藥研發(fā)、生物化學(xué)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。

一、非酶法抗氧化活性檢測的重要性

非酶類抗氧化物質(zhì)是機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)的重要組成部分，包括維生素（如維生素 C、維生素 E）、多酚類化合物（如黃酮類、酚酸類）、類胡蘿卜素、谷胱甘肽（非酶促狀態(tài)下）等。這些物質(zhì)通過直接清除自由基、螯合金屬離子、抑制氧化酶活性等方式發(fā)揮抗氧化作用。與酶法抗氧化系統(tǒng)（如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶等）相比，非酶類抗氧化物質(zhì)的來源更廣泛，不僅存在于生物體內(nèi)，還大量存在于植物、食品等天然產(chǎn)物中。

非酶法抗氧化活性檢測能夠綜合評估樣本中所有非酶抗氧化物質(zhì)的總抗氧化能力，或針對特定類型的抗氧化物質(zhì)進(jìn)行活性測定，為篩選天然抗氧化劑、研究抗氧化機(jī)制、評估食品營養(yǎng)價值、開發(fā)抗氧化藥物等提供重要依據(jù)。

二、常見非酶法抗氧化活性檢測方法

總抗氧化能力（TAC）檢測法

總抗氧化能力檢測法是評估樣本中所有抗氧化物質(zhì)協(xié)同作用的綜合指標(biāo)，常用的方法包括：

• 鐵離子還原抗氧化能力法（FRAP 法）

原理：在酸性條件下，樣本中的抗氧化物質(zhì)能將三價鐵離子（Fe3?）還原為二價鐵離子（Fe2?），F(xiàn)e2?與三吡啶三吖嗪（TPTZ）結(jié)合形成藍(lán)紫色復(fù)合物，在 593nm 處有最大吸收峰。通過測定吸光度的變化，可計(jì)算樣本的抗氧化活性，吸光度越大，抗氧化能力越強(qiáng)。

操作要點(diǎn)：反應(yīng)體系通常為 pH3.6 的醋酸緩沖液、10mmol/L TPTZ 溶液和 20mmol/L FeCl?溶液按 10:1:1 混合，加入樣本后 37℃孵育一定時間，測定吸光度。該方法操作簡便、快速，適用于大量樣本的篩查，但受反應(yīng)時間和溫度影響較大。

適用范圍：適用于植物提取物、食品、血清等樣本的總抗氧化能力測定。

• 2,2'- 聯(lián)氮 - 雙 - 3 - 乙基苯并噻唑啉 - 6 - 磺酸（ABTS）法

原理：ABTS 在過氧化物和金屬離子作用下生成穩(wěn)定的藍(lán)綠色陽離子自由基（ABTS??），樣本中的抗氧化物質(zhì)可清除 ABTS??，使溶液顏色變淺，在 734nm 處的吸光度降低。通過吸光度的變化計(jì)算抗氧化活性，吸光度降低越多，抗氧化能力越強(qiáng)。

操作要點(diǎn)：先制備 ABTS??工作液，將 ABTS 溶液與過硫酸鉀溶液混合，室溫避光孵育 12-16 小時，使用前用磷酸鹽緩沖液稀釋至吸光度為 0.70±0.02。加入樣本后反應(yīng)一定時間，測定吸光度。該方法靈敏度高，可在水相和有機(jī)相中進(jìn)行，適用于多種類型的樣本。

適用范圍：廣泛應(yīng)用于食品、藥物、植物提取物等的總抗氧化能力檢測。

• 1,1 - 二苯基 - 2 - 三硝基苯肼（DPPH）法

原理：DPPH 是一種穩(wěn)定的自由基，在 517nm 處有強(qiáng)吸收，呈紫色。當(dāng)樣本中存在抗氧化物質(zhì)時，DPPH 自由基被清除，溶液顏色變淺，吸光度降低。通過吸光度的變化計(jì)算自由基清除率，清除率越高，抗氧化活性越強(qiáng)。

操作要點(diǎn)：將 DPPH 乙醇溶液與樣本混合，室溫避光反應(yīng) 30 分鐘后，測定 517nm 處的吸光度。該方法操作簡單、快速，成本低，但受溶劑極性影響較大，對脂溶性抗氧化物質(zhì)的檢測效果較好。

適用范圍：常用于植物提取物、食品、化妝品等的抗氧化活性初步篩選。

基于自由基清除的特異性檢測法

除了總抗氧化能力檢測，還有針對特定自由基的清除能力檢測方法，以評估樣本對不同類型 ROS 的清除效果：

• 超氧陰離子自由基（O???）清除法

原理：通過黃嘌呤 - 黃嘌呤氧化酶體系產(chǎn)生 O???，O???可還原氮藍(lán)四唑（NBT）生成藍(lán)色甲臜，樣本中的抗氧化物質(zhì)清除 O???后，甲臜生成量減少，在 560nm 處的吸光度降低。

操作要點(diǎn)：反應(yīng)體系包括黃嘌呤、黃嘌呤氧化酶、NBT 和樣本，37℃孵育一定時間后測定吸光度。該方法特異性較高，可反映樣本對 O???的清除能力。

適用范圍：適用于研究樣本在生物體內(nèi)的抗氧化機(jī)制，尤其是與炎癥、衰老相關(guān)的氧化應(yīng)激過程。

• 羥基自由基（?OH）清除法

原理：通過 Fe2?與 H?O?反應(yīng)（Fenton 反應(yīng)）產(chǎn)生?OH，?OH 可氧化脫氧核糖生成丙二醛等產(chǎn)物，TBA反應(yīng)生成紅色復(fù)合物，在 532nm 處有吸收峰。樣本中的抗氧化物質(zhì)清除?OH 后，紅色復(fù)合物生成量減少，吸光度降低。

操作要點(diǎn)：反應(yīng)體系含 FeSO?、H?O?、脫氧核糖、TBA 和樣本，37℃孵育后沸水浴加熱，冷卻后測定吸光度。該方法可特異性檢測樣本對?OH 的清除能力，?OH 是活性*強(qiáng)的 ROS 之一，對細(xì)胞損傷較大，因此該方法具有重要的生物學(xué)意義。

金屬離子螯合能力檢測法

許多氧化反應(yīng)依賴金屬離子（如 Fe2?、Cu2?）的催化，抗氧化物質(zhì)通過螯合這些金屬離子，可抑制氧化反應(yīng)的發(fā)生。常用的方法是亞鐵離子螯合能力檢測法：

原理：樣本中的抗氧化物質(zhì)與 Fe2?結(jié)合，形成穩(wěn)定的螯合物，從而抑制 Fe2?與菲啰嗪的反應(yīng)。菲啰嗪與 Fe2?結(jié)合生成紅色復(fù)合物，在 562nm 處有吸收峰，螯合能力越強(qiáng)，紅色復(fù)合物生成越少，吸光度越低。

操作要點(diǎn)：將樣本與 FeSO?溶液混合，孵育后加入菲啰嗪，測定吸光度。該方法適用于評估樣本中具有金屬螯合能力的抗氧化物質(zhì)（如多酚類、氨基酸等）的活性。

脂質(zhì)過氧化抑制法

脂質(zhì)過氧化是指多不飽和脂肪酸在 ROS 作用下發(fā)生氧化分解的過程，會產(chǎn)生丙二醛等有害物質(zhì)。通過檢測樣本對脂質(zhì)過氧化的抑制能力，可評估其抗氧化活性：

原理：以亞油酸或大鼠肝勻漿等為脂質(zhì)體系，在氧化條件下（如 Fe2?催化）發(fā)生脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生的丙二醛與 TBA 反應(yīng)生成紅色復(fù)合物，樣本中的抗氧化物質(zhì)可抑制脂質(zhì)過氧化，使紅色復(fù)合物生成量減少。

操作要點(diǎn)：將樣本與脂質(zhì)體系、Fe2?溶液混合，孵育一定時間后加入 TBA，沸水浴加熱，測定 532nm 處的吸光度。該方法模擬了生物體內(nèi)脂質(zhì)的氧化過程，更接近生理?xiàng)l件，適用于研究樣本對生物膜氧化損傷的保護(hù)作用。